本文通过构建核内小分子RNA的cDNA文库和序列测定,在粟酒裂殖酵母基因组中共发现了44种box C/D snoRNA的基因序列.BLAST搜索粟酒裂殖酵母基因组数据库得知,这44种通过文库筛到的box C/D snoRNA中,除U14,snR38和snR39已有报道外,另外13种已由其它实验室利用生物信息学的方法预测到并在粟酒裂殖酵母基因组上进行了注释,其余的28种为新的snoRNA.Northern杂交结果显示,这些snoRNA都有很强的阳性杂交带,其大小与预期的RNA分子相符,表明它们是粟酒裂殖酵母细胞中稳定表达的RNA分子.逆转录实验进一步验证这些snoRNA的存在.根据snoRNA的结构和功能的关系,预测27种新的snoRNA可指导32个rRNA位点和一个U6 snRNA位点甲基化修饰.采用dNTP浓度依赖性引物延伸分析对部分新的snoRNA指导的甲基化位点进行鉴定,在粟酒裂殖酵母18S和25S rRNA上标定了36个甲基化修饰的位点.这36个位点中,有26个在S.cerevisiae,动物以及植物rRNA中相应位点的核苷酸有被甲基化修饰,同时在S.cerevisiae,动物以及植物中发现了指导这些位点2′-O-核糖甲基化修饰的反义snoRNA,其余的位点为粟酒裂殖酵母所特有的甲基化位点.基因组织分析显示,几乎所有粟酒裂殖酵母box C/D snoRNA是由内含子编码的.表明粟酒裂殖酵母box C/D snoRNA的基因组织不同于酿酒酵母而与脊椎动物非常类似.然而,与脊椎动物不完全相同,粟酒裂殖酵母内含子编码的snoRNA只有7个位于蛋白质基因的内含子中,其余均位于非编码RNA基因的内含子中或蛋白质编码基因3或5末端非翻译区的内含子中.在粟酒裂殖酵母snoRNA基因簇Ⅱ中发现了一种特殊的基因结构形式,分别编码snR57和snR55的两个内含子紧密相连,中间没有插入外显子序列,称为连体内含子.RT-PCR分析和RT-PCR产物的斑点杂交结果显示,这种连体内含子是按顺序剪接的,两个内含子编码的snoRNA snR57和snR55先通过RNA剪接,然后,经核酸酶作用去除分枝的套索结构依次从多顺反子转录前体释放.比较分析不同生物的box C/D snoRNA的功能同源分子及其指导的甲基化位点,发现snoRNA基因在进化过程中发生了广泛的重组和转位.有些snoRNA来源于同一snoRNA分子的重复及随后的序列变异,重复的snoRNA基因可以通过染色体重复产生,也可以通过内含子的转座产生.通过对粟酒裂殖酵母box C/D snoRNA的系统研究,我们不仅发现罕见的基因结构"连体内含子",也发现了粟酒裂殖酵母box C/D snoRNA基因独特的基因组织和表达策略.这些研究成果丰富了人们对snoRNA基因结构与表达的认识,为内含子的起源和进化提供了新的材料.