目前延边黄牛体细胞克隆技术已经取得了显著的成就,但是克隆胚胎发育率低下仍然是亟待解决的问题之一。有研究表明这可能与体外操作和培养过程中卵母细胞、供核细胞以及重组胚的细胞过度凋亡有关。因此设计本试验,以研究体外供核细胞培养过程中的细胞生长状态,并试图通过影响Bcl-2/Bax比率抑制H202诱导的细胞凋亡。目的：(1)检测延边黄牛不同传代次数的耳部成纤维细胞的形态特征；(2)测定特定条件应激下不同代数延边黄牛成纤维细胞的细胞活力；(3)克隆并测定延边黄牛Bax基因和Bcl-2基因相关序列；(4)探究H202对延边黄牛体外培养的成纤维细胞的影响及损伤模型的确定；(5)探究siRNA转染对延边黄牛成纤维细胞活性的影响(6)测定siRNA转染对延边黄牛成纤维细胞Bax基因和Bcl-2基因表达的影响。方法与内容：(1)体外培养并获取延边黄牛的成纤维细胞系,并对指定代数细胞进行图像采集；(2)对体外培养的不同代数延边黄牛成纤维细胞分别进行冷冻处理、H202刺激,再进行MTT活力测定,并与正常传代的细胞进行对比；(3)用延边黄牛耳成纤维细胞提取的总RNA做模版,反转录PCR扩增相应基因,然后克隆到T载体上,再经过转化菌扩增后提取重组质粒进行鉴定和序列分析；(4)用不同浓度H202处理处于对数期的延边黄牛成纤维细胞,特定作用时间后测定细胞活力；(5)设计并合成相应基因siRNA,脂质体转染入细胞后测定细胞活力；(6)以转染siRNA的延边黄牛成纤维细胞总RNA为模版,扩增各组别细胞Bax基因和Bcl一2基因并电泳检测产物,用相关软件对目的条带亮度进行分析。结果与讨论：(1)试验中的各代数延边黄牛成纤维细胞在形态学上并无明显差异；(2)正常传代的4、7、10和13代延边黄牛成纤维细胞活力差异不显著：玻璃化冷冻再复苏的4代和7代延边黄牛成纤维细胞差异不显著,但均与10代与13代差异显著：H202处理后4代和7代细胞无明显差异但与10代差异显著,13代细胞活力最低并与前三者均差异显著；表明随着细胞代数的增加细胞对外界环境的抗性也在随之下降；(3)成功克隆了延边黄牛Bax基因CDS区112bp序列和Bcl-2基因365bp序列,并发现与已公布黄牛对应序列是一致的,表明延边黄牛该基因相对比较保守；(4)100μM H202处理组与空白组差异不明显,200μM H202处理3h时成纤维细胞活力显著下降,并在后期有恢复现象；400μM以上组细胞活力只呈现出下降的趋势,无明显恢复迹象。表明400μM以上浓度对细胞毒性过大,合适诱导的H202浓度和处理时间是200μM处理1h；(5)相对于未干扰组,siRNA干扰组细胞活力均有不同程度上升除13代细胞外其他组细胞活力间显著性差异,表明利用siRNA转染的方法可以提高延边黄牛耳成纤维细胞的抗凋亡能力；(6)转染Bax-siRNA后,细胞内Bax水平显著下降,而对Bcl-2表达影响不大,致使Bcl-2、Bax比率上升。H202模型诱导的成纤维的细胞凋亡可能是通过Bcl-2家族介导的,而siRNA的转染有望抑制因H2O2导致的细胞凋亡。