论文部分内容阅读
七鳃鳗是一种古老的无颌类动物,在进化上处于无脊椎动物和脊椎动物之间,对免疫系统的研究在理论上有着重要的进化意义。Toll样受体是非特异性模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs),能够识别病原体,是启动先天免疫的关键。本研究克隆获得东北七鳃鳗(Lethenteron morii)TLR7a、TLR7b、TLR14d和TLR2d基因,利用实时荧光定量PCR分析4个TLR基因在幼鱼和成鱼中各组织的表达情况以及在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)刺激后不同组织在不同时间点的表达量变化。构建真核表达载体并检测TLR14d和TLR2d在HEK293T细胞中的定位。为深入探索TLR基因的功能及其信号转导过程,本研究也进行TLR通路相关接头分子(MyD88和TRAF6)以及下游转录因子NF-кB家族成员及其启动子的研究,现取得以下结果:1.东北七鳃鳗TLR基因克隆及生物信息学分析:采用克隆技术获得4个TLR基因的cDNA序列,TLR7a、TLR7b、TLR14d和TLR2d的开放阅读框(ORF)分别为3252 bp、3117 bp、2241 bp和2439 bp;编码1083、1038、746和812个氨基酸。除了TLR14d缺少LRR结构域,另外的3个TLR均具有LRR结构、跨膜区和TIR结构。系统进化树分析显示,TLR7a、TLR7b分别与哺乳类以及鱼类的TLR7聚为一支;TLR14d、TLR2d分别与哺乳类、鸟类、两栖类以及硬骨鱼类的TLR2亚家族聚为一支,其中TLR14d与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)TLR14的亲缘关系最近。2.东北七鳃鳗TLR基因组织表达分析:利用获得的东北七鳃鳗TLR基因的cDNA序列,设计定量引物,荧光定量PCR的结果显示,TLR基因在健康东北七鳃鳗幼鱼和成鱼所检测的组织中均有表达。4个TLR基因在幼鱼的心中均有最高的表达量;TLR7b、TLR14d在成鱼的脑中均有最高的表达量。除此之外,这4个TLR基因均在免疫相关组织中有较高的表达量,如脂肪体、肝、皮肤等。荧光定量PCR分析TLR基因在铜绿假单胞菌刺激后的表达量变化,结果显示,TLR基因可以被细菌诱导表达,但是不同组织在不同时间点的表达情况不同,TLR7a表达量在脂肪体、鳃、肠、肾中显著上调;TLR7b表达量在脂肪体和肾中显著上调;TLR14d表达量在脂肪体、鳃、肾中显著上调;TLR2d表达量在脂肪体、鳃、肾中显著上调,但是在肠中显著下调。3.东北七鳃鳗TLR基因亚细胞定位:将pCMV-TLR重组质粒转染HEK293T细胞,观察其在细胞中的定位情况。结果表明,TLR14d定位于细胞的细胞核和细胞质及多个细胞器中;TLR2d定位于细胞的细胞质及多个细胞器中。4.东北七鳃鳗TLR信号通路相关接头分子克隆及生物信息学分析:采用克隆技术获得MyD88和TRAF6基因的cDNA序列,MyD88的开放阅读框(ORF)为852 bp,编码283个氨基酸;该序列包含1个死亡结构域和1个TIR结构域。TRAF6的开放阅读框(ORF)为1785 bp,共编码594个氨基酸;该序列包含1个RING结构域、2个锌指结构、1个环-环(coiled-coil)α螺旋结构以及MATH结构域。系统进化树显示,MyD88和TRAF6分别与哺乳类、鸟类、两栖类以及硬骨鱼类的MyD88和TRAF6聚为一支。5.东北七鳃鳗TLR信号通路相关接头分子组织表达分析:利用获得的MyD88和TRAF6基因的cDNA序列,设计定量引物,荧光定量PCR的结果显示,MyD88在健康东北七鳃鳗幼鱼和成鱼的各组织中均有表达,属于组成型表达,幼鱼在皮肤和鳃中的表达量较高;成鱼在肌肉和肾中表达量较高。TRAF6在健康东北七鳃鳗幼鱼和成鱼的各组织中均有表达,幼鱼在皮肤、鳃中表达量较高,成鱼在肾、鳃中表达量较高。荧光定量PCR分析MyD88和TRAF6基因在铜绿假单胞菌刺激后的表达量变化,结果显示,在细菌刺激后,鳃、肾、脂肪体中MyD88表达量分别在12 h、24 h和48 h显著上调;脂肪体中TRAF6表达量在12 h显著上调,鳃、肠、肾中TRAF6表达量在24 h显著上调。6.东北七鳃鳗NF-кB家族同源基因克隆及生物信息学分析:采用克隆技术获得4个Rel基因的cDNA序列,Rel-a、Rel-b、Rel-c和Rel-d的开放阅读框(ORF)分别为1011 bp、999 bp、900 bp和999 bp;编码336、332、299和332个氨基酸。4个Rel基因均包含1个RHD结构和1个IPT结构。系统进化树显示,4个Rel基因与哺乳类以及鱼类的Rel聚为一支。7.东北七鳃鳗NF-кB家族同源基因组织表达分析:利用获得的4个Rel基因的cDNA序列,设计定量引物,荧光定量PCR的结果显示,Rel-a、Rel-b在幼鱼的鳃中有较高水平的表达量;Rel-c、Rel-d在幼鱼的皮肤中有较高水平的表达量。Rel-a、Rel-c分别在成鱼的肌肉和心中有最高的表达量;Rel-b、Rel-d在成鱼的鳃中有较高水平的表达量。8.东北七鳃鳗NF-кB家族同源基因的启动子活性分析:采用克隆技术获得4个Rel基因启动子的DNA序列,发现它们均具有重要的转录结合位点,如Oct-1、GATA-1、AP-1、NF-1、SP-1等。除了Rel-c启动子,其它3个启动子均具有与转录密切相关的TATA Box和CAAT Box转录元件。双荧光素酶报告基因的结果表明,Rel-b启动子的活性最高,是对照组的8.77倍。9.东北七鳃鳗TLR基因过表达对Rel-b启动子活性的影响:双荧光素酶报告基因的结果表明,TLR14d和TLR2d在一定程度上抑制Rel-b启动子活性;但TLR14d和TLR2d与接头分子Myd88共转时可显著增强Rel-b启动子活性。综上所述,本研究首次在东北七鳃鳗上克隆4个TLR基因(TLR7a、TLR7b、TLR14d和TLR2d)的cDNA全长序列,分析其在不同组织不同生长阶段和细菌感染后的表达情况,并鉴定TLR14d和TLR2d在HEK293T细胞中的定位情况。为深入研究TLR基因的功能,本研究也克隆了TLR通路相关接头分子(MyD88和TRAF6)以及下游转录因子NF-кB家族成员及其启动子,并检测TLR基因过表达对Rel-b启动子活性的影响。为研究东北七鳃鳗TLR基因功能及其在TLR信号转导中的功能提供理论依据。