柠条锦鸡儿是广泛分布于我国干旱半干旱地区的多年生落叶灌木,因其强抗旱性成为黄土高原退耕还林的优势物种。木质素是植物苯丙烷合成途径重要的次生代谢产物之一,其可增强植株的机械强度、保障输导组织的水分运输。实验室前期研究表明随干旱加剧柠条叶脉木质部愈加发达。对黄土高原从南到北降水量依次减少的三个采样点的(黄陵、榆林和达拉特旗)柠条叶片进行RNA-Seq分析,发现柠条苯丙烷合成途径位居差异表达的代谢途径之首,且木质素合成相关酶基因的表达量显著上调。本研究旨在阐明柠条木质素合成关键酶基因的干旱响应模式,为揭示干旱加剧引起木质部愈加发达进而提高抗旱性的研究奠定基础。为此以野外降水量梯度上和室内单因素控水处理(对照、中度干旱和重度干旱)的柠条叶片为研究对象,分别从基因、蛋白和生理水平验证木质素对干旱的响应,同时克隆木质素合成途径关键酶基因CkC4H及转录因子基因CkMYB39,转化拟南芥,获得CkC4H和CkMYB39转基因植株,拟验证柠条木质素合成基因和调控因子通过强化木质部而提高植株抗旱性的功能。本研究试验结果如下:(1)通过对RNA-Seq数据的分析发现,柠条木质素合成途径上主要有7个基因的表达量随降水减少呈现上调趋势。通过实时荧光定量PCR分别检测每一个基因在分别对应的野外样品和室内样品中的相对表达量,结果表明:野外样品中CkPAL、CkC4H、CkC3H、CkCOMT、CkCCR、CkCAD基因的表达量随干旱加剧呈现逐渐增加的趋势,Ck4CL基因的表达量呈现先减后增的趋势;室内样品中Ck C4H、CkCOMT、CkCAD基因的表达量随土壤含水量降低呈现逐渐增加的趋势,CkPAL、Ck4CL、CkC3H、CkCCR基因的表达量呈现先减后增的趋势。(2)制备柠条木质素合成途径关键酶蛋白Ck C4H和CkC3H的兔源多克隆抗体,检测其在野外和室内样品中的相对含量变化趋势。Western blot结果表明:随着干旱程度加剧,无论是在野外样品和室内样品中,CkC4H和CkC3H酶蛋白的表达量均显著增加。同时CkC4H和CkC3H酶蛋白的灰度值分析也佐证了以上试验结果。(3)木质素合成途径主要形成3种木质素单体,间苯三酚会对G和H两种木质素单体着色,莫尔反应会对S木质素单体着色。染色结果表明:随着干旱程度加剧,无论是在野外样品还是室内样品中,维管束面积、厚壁组织面积和木质部面积均有逐渐增大的趋势,且统计结果分析显示:随着干旱加剧,木质素着色面积与整个维管束面积的比值呈现显著增加的趋势。(4)利用乙酰溴-紫外分光光度法测定柠条叶片木质素含量,测定结果表明:随着干旱程度加剧,野外和室内柠条叶片样品中木质素含量均表现出显著增加的趋势。(5)成功构建35S::CkC4H和35S::CkMYB39过表达载体,瞬时转化本氏烟草叶片,激光共聚焦显微镜观察蛋白质的亚细胞定位,结果表明:CkC4H酶蛋白定位于细胞膜,CkMYB39转录因子定位于细胞核。(6)将构建成功的35S::CkC4H、35S::CkMYB39过表达载体利用花序法浸染拟南芥,已获得两个目的基因和空载体pCAMBIA1302的T2代植株。综合上述研究结果获得以下试验结论:柠条在干旱胁迫下通过提高木质素合成途径上相关酶基因和蛋白的表达量,从而提高木质素含量。木质素在木质部导管和厚壁组织的沉积是柠条形成发达木质部耐受干旱的重要机制之一。