论文部分内容阅读
目的：构建乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子区(BCP)1762/1764双突变株的重组质粒。检测HBV相关性肝细胞癌(HCC)病人肝癌组织中BCP区A1762T/G1764A双突变和乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的表达，分析此双突变对HBx表达的影响，探讨其对HCC发生、发展的关系及意义。 方法：(1)利用已有1.5拷贝HBV野生型全基因组序列质粒（pHBV1.5，C型）为模板，采用分子克隆、大引物定点突变方法构建BCP区A1762T/G1764A双突变重组质粒。(2)将野生株重组质粒和双突变重组质粒分别转染到HepG2.0细胞，测定其细胞培养液乙肝表面抗原(HBsAg)水平来确定双突变质粒的蛋白表达能力。(3)以野生株重组质粒和双突变重组质粒基因序列设计特异性TaqMan MGB探针。(4)采用特异性探针实时荧光定量PCR(PSRT-PCR)方法准确检测样本双突变。(5)采用蛋白质免疫印迹法(Western-blot)检测重组质粒转染后的HepG2.0细胞和乙肝相关性肝细胞癌患者肝癌组织的HBx表达。(6)统计学分析采用SPSS16.0统计学软件处理，计量资料采用t检验、F检验，计数资料采用x2检验和Fisher确切概率法。 结果：(1)成功构建BCP区A1762T/G1764A双突变重组质粒。(2)成功制作用于同时检测HBV DNA和双突变拷贝量的TaqMan MGB探针。(3)成功使用PSRT-PCR方法快速、特异、准确检测乙肝病毒HBV BCP区A1762T/G1764A双突变。(4)体外实验显示，转染具有BCP区A1762T/G1764A双突变重组质粒的HepG2.0-M细胞株HBx表达水平高于转染野生型重组质粒的HepG2.0-W细胞株[86.67％(26/30) vs36.67％(11/30)，x2=15.864，p＜0.001]。(5)临床实验显示，具有BCP区A1762T/G1764A双突变的肝癌细胞HBx表达水平高于无此双突变的肝癌细胞[65.31％(32/49) vs36.84％(7/19),x2=4.535,p=0.033]。 结论：(1)体外实验和临床实验均显示，具有BCP区A1762T/G1764A双突变的肝癌细胞，其HBx表达高于无此双突变的细胞，提示此双突变提高HBx表达，促进了HCC的发生和发展。(2)使用特异性TaqMan MGB探针的PSRT-PCR检测方法检测双突变具有良好的灵敏度、特异性和重复性，达到临床检测要求。