汉坦病毒(hantaan virus,HV)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantavirus),是肾综合征出血热(hemorrhagic feverwith renal syndrome,HFRS)的病原体。HFRS是严重危害人体健康的急性病毒性传染病,临床上尚无特异性治疗药物,疫苗的研制及应用是预防和控制其流行的重要措施。HV病毒的核酸为单股负链RNA,基因组由L、M、S三个片段组成,分别编码病毒的聚合酶、包膜糖蛋白(G1、G2)和核衣壳蛋白(NP)。M片段编码的G1、G2包膜糖蛋白含有病毒的毒力位点、中和性抗原及型特异性抗原位点等多种抗原决定簇,因此M片段是一个很好的疫苗候选抗原[1]。根据血清学检查,引起HFRS的病原体主要是汉坦病毒的两个亚型即汉滩病毒(HTNV)和汉城病毒(SEOV),但是近年来出现了很多病毒变异株。传统疫苗制作过程复杂、时间长,其保护作用比较单一、造价高,且有病毒毒力“返祖”现象,多抗原组分可诱发自身免疫性疾病等缺点,所以需要研制一种新型高效疫苗。核酸疫苗具有制作过程简单,经济可靠、不接触病原体、可以精选所需要的基因片段、不表达无关抗原等优点,给Hv疫苗的研制提供了新的思路。　　 针对目前一般核酸疫苗免疫原性较低及HV混合感染的现象,我们在实验中使用两个启动子、以HTNV和SEOV的M2基因片段为抗原基因,利用反向疫苗学技术,构建两个启动子头尾相接的顺式和头头相接的反式双价真核表达载体,观察两个载体能否在真核细胞中表达及其对动物的免疫效果。同时探讨两个启动子及启动子的排列方式对其免疫活性是否有影响,以期构建出一种多基因高效疫苗,为HV疫苗的研制奠定基础。　　 方法：　　 一、构建pETBlue2-CM1重组表达载体：　　 (一)真核表达元件的获取　　 参照载体构建方法,设计引物扩增真核表达元件即CMV启动子、多克隆酶切位点及polyA部分,将此真核表达元件命名为CM1。利用PCR在CM1的两端添加合适的酶切位点,根据添加酶切位点的顺序不同,将片段分为正向和反向,称为正向CM1和反向CM1。将PCR产物琼脂糖凝胶电泳后回收,-20℃保存。　　 (二)pETBlue2-CM1载体的构建　　 将得到的正向CM1和反向CM1分别插入pETBlue2载体中,构建pETBlue2-正向CMI和pETBlue2-反向CMI重组载体。酶切鉴定后进行序列分析。　　 二、两型M2基因片段的获取：　　 应用反向疫苗学技术,对两性M2基因片段的抗原决定簇、跨膜蛋白等进行预测分析,确定PCR扩增的片段。设计两对引物,扩增HTNV76118M2和SEOVSeoulBjHD01M2片段(简称SEOM2),并利用PCR在基因的两端添加CpG序列和合适的酶切位点。琼脂糖凝胶电泳回收后-20℃保存。　　 三、构建pETBlue2-正向/反向CM1-76118M2载体：　　 按载体构建的常规方法,将76118M2片段分别插入pETBlue2-正向CM1和pETBlue2-反向CM1重组表达载体中,构建pETBlue2-正向CM1-76118M2和pETBlue2-反向CM1-76118M2载体。酶切鉴定后进行序列分析。　　 四、单质粒单启动子载体的构建：　　 (一)pcDNA3.1+76118M2载体的构建　　 将76118M2片段插入真核表达载体pcDNA3.1+中,构建pcDNA3.1+76118M2载体。酶切鉴定后进行序列分析。　　 (二)pcDNA3.1+SEOM2载体的构建：、　　 将SEOM2片段插入真核表达载体pcDNA3.1+中,构建pcDNA3.1+SEOM2载体。酶切鉴定后进行序列分析。　　 五、单质粒顺式和反式双启动子双基因真核表达载体的构建：　　 将pETBlue2-正向CM1-76118M2和pETBlue2-反向CM1-76118M2载体中含真核表达元件和目的基因的部分分别插入pcDNA3.1+SEOM2中,构建单质粒顺式pcDNA3.1+SEOM2-CM1-76118M2和反式pcDNA3.1+SEOM2-CM1-76118M2真核表达载体。　　 六、双启动子双基因载体在真核细胞中的瞬时表达：　　 将构建的单质粒顺式和反式双启动子双基因载体转染真核细胞Vero-6,培养48小时后用间接免疫荧光检测其在真核细胞中的表达情况。　　 七、双启动子双基因载体在动物体内免疫活性的检测：　　 (一)动物免疫　　 取90只小鼠,随机分为6组,分别注射pcDNA3.1+、pcDNA3.1+76118M2、pcDNA3.1+SEOM2、pcDNA3.1+76118M2与pcDNA3.1+SEOM2联合、顺式pcDNA3.1+SEOM2-CM1-76118M2和反式pcDNA3.1+SEOM2-CM1-76118M2质粒,质粒通过肌肉注射,两周以后加强免疫一次,共免疫三次。　　 (二)血清特异性抗体及细胞因子的检测　　 初次免疫后1d、7d、17d、31d、60d、90d后收集各免疫组小鼠的血清及脾细胞培养上清液,用ELISA法检测各组血清中特异性IgG抗体、脾细胞培养上清液中细胞因子IFN-γ、IL-4及IL-10水平。用MTT法检测脾淋巴细胞增殖水平,从而判断质粒对动物的免疫效果。　　 结果：　　 一、pETBlue2重组片段载体的鉴定　　 (一)真核表达元件的获取　　 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,获得大小约为1000bp的条带,与预期结果一致。　　 (二)pETBlue2重组片段载体的鉴定　　 用Xhol单酶切pETBlue2-正向CM1和pETBlue2-反向CM1重组片段载体,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,前者得到两个大小约为4200bp和350bp的条带,后者获得两个大小约为3700bp和850bp的条带,与预期结果一致.经序列分析,所得的结果与Geneballk中相应的核苷酸序列比对,同源性达100％。　　 二、双型M2基因片段的获取　　 PCR扩增的76118M2产物经琼脂糖凝胶电泳后获得大小约1300bp条带,扩增SEOM2获得大小约10001bp)条带,与预期结果一致。　　 三、pETBlue2-正/反向CM1-76118M2载体的鉴定所得的正向和反向载体经Xhol单酶切后琼脂糖凝胶电泳,前者获得两个大小约为5500bp和350bp的条带,后者获得两个大小约为3700bp和2100bp的条带,与预期结果一致。经序列分析,所得的结果与Genebank中相应的核苷酸序列比对,同源性达100％。　　 四、单质粒单启动子载体的鉴定　　 (一)pcDNA3.1+76118M2载体的鉴定　　 所得的载体经Pst I单酶切后琼脂糖凝胶电泳,获得大小约为5200bp和1000bp的两个条带,与预期结果一致。经序列分析,所得的结果与Genelbank中相应的核苷酸序列比对,同源性达100％。　　 (二)pcDNA3.1+SEOM2载体的鉴定　　 所得的载体经Pst I和EcoR I双酶切鉴定后琼脂糖凝胶电泳,获得两条大小约为4200bp和1900bp的条带,与预期结果一致。经系列分析,所得的结果与GenebDank中相应的核苷酸序列比对,同源性达100％。　　 五、顺式和反式双启动子双基因载体的酶切鉴定　　 单质粒顺式和反式双启动子双基因载体经XhoI单酶切后琼脂糖凝胶电泳,前者获得两个大小约为6500bp和1800bp的条带,后者获得两个大小约为4700bp和3600bp的条带,与预期结果一致。　　 六、双启动子双基因真核表达载体在真核细胞中的瞬时表达　　 将构建的两种载体转染Vero-6细胞后,均可在细胞浆中观察到绿色荧光,说明两个重组质粒都能在真核细胞Vero-6中正常表达。　　 七、双启动子双基因真核表达载体在动物体内的免疫活性检测　　 ELISA结果显示,双启动子双基因载体免疫组小鼠产生的抗体和细胞因子水平明显高于其他四组,差异显著(P<0.01)。其中,顺式双启动子双基因载体组高于反式双启动子双基因载体组,差异显著(P<0.01)。　　 结论：　　 1、成功构建了汉坦病毒顺式和反式双启动子双基因真核表达载体。　　 2、与单启动子单基因载体相比,双启动子双基因载体诱导小鼠产生的细胞免疫和体液免疫效应更好。　　 3、与两个单启动子单基因载体联合免疫相比,单质粒双启动子双基因载体引起的免疫效应更好。　　 4、与反式双启动子双基因载体相比,顺式双启动子双基因载体免疫活性更好。