在高糖和TGF-β等病理性因素诱导下，肾小管上皮细胞发生上皮间质转化，产生过多的胶原蛋白是造起肾小管间质纤维化的重要原因。miRNA是近年来发现的长度约22个核苷酸的非编码小RNA，目前已有研究表明miRNA从多个环节参与调节肾脏纤维化，但其机制不清。　　 为了开展TIF中miRNA研究，我们利用miRNA芯片技术平台，建立了一种永生化的人PTCs细胞系-HK-2细胞的miRNA表达谱。为了进一步研究这些miRNA功能，我们进行了以下两个方面的研究，以探讨引起PTCs中miRNA紊乱造成TIF新的分子机制。　　 第一部分高糖下调HK-2细胞中miR-29a增加Ⅳ型胶原表达　　 miRNA表达芯片结果显示，高糖处理后有14个miRNA的表达量变化超过了30％。在这些miRNA之中，miR-29a表达量变化最大，而且它也属于HK-2细胞中40个丰度最高的miRNA，因此我们把miR-29a作为下一步研究的对象。　　 我们利用real-time PCR和northern blot等方法验证了上述芯片的结果。两者的结果与芯片结果一致：高糖诱导后miR-29a表达下调了40-50％。同时我们还证实，TGF-β1同样可显著下调HK-2细胞中miR-29a的表达水平。　　 在糖尿病肾病发展过程中，Ⅳ型胶原表达增加是TIF的重要病理特征之一。因此，高糖下调miR-29a可能引起Ⅳ型胶原增加。首先，我们用western blot的方法证实高糖可使HK-2细胞中Ⅳ型胶原表达显著升高，表明PTCs中Ⅳ型胶原和miR-29a的表达呈负相关性。接下来，我们分别在HK-2细胞中抑制和过表达miR-29a，结果显示miR-29a作为一种抑制分子控制着HK-2细胞中Ⅳ型胶原表达水平。最后，报告基因的结果证实，miR-29a直接调控co14a1和co14a2的表达，从而发挥其控制Ⅳ型胶原蛋白表达的功能。　　 第二部分 TGF-β1下调肾小管上皮细胞中miR-30促进上皮间质转化　　 首先，我们用miRNA芯片方法分析了TGF-β1诱导前后，HK-2细胞中miRNA的表达变化情况。结果显示，HK-2细胞中丰度最高的miR-30家族成员miR-30a-e等5个miRNA下调约2倍。我们用Real-time PCR的方法验证了芯片结果，发现miR-30a-e显著下调。接着，我们在单侧输尿管梗阻(UUO)诱导EMT动物模型中验证了miR-30的作用。这样，我们就从体内、体外两方面的实验证实，miR-30下调是肾小管间质纤维化的显著特征。　　 为了探讨miR-30下调对EMT的调控作用，我们在HK-2细胞中分别转染对照序列和anti-miR-30a-e序列。HK-2细胞中出现了很多梭形细胞，细胞出现了类似于EMT的形态变化，western blot结果E-cadhein的表达水平下降，而snail和ZEB2的表达上调。这表明，下调miR-30可直接诱导肾小管上皮细胞发生EMT。　　 为了验证miR-30可直接调控snail，ZEB2，我们构建了4个荧光素酶报告基因载体分别包含snail和ZEB2的3UTR中miR-30预测序列及其突变序列。结果显示，miR-30可分别下调snail，ZEB2基因3UTR相应位点荧光素酶活性到53％和75％；而其对应的突变序列活性则分别回复到92％和94％。这说明miR-30是直接调控snail和ZEB2，造成EMT，进而引起肾小管间质纤维化。　　 综上所述，本课题首次证明了PTCs中miR-29a和miR-30表达异常能够引起胶原沉积和EMT，从而介导了TIF。本课题揭示了肾小管间质纤维化过程中miRNA调控的新机制，这有助于厘清肾小管间质纤维化的发病机理，同时为确立miRNA作为该病的治疗新靶点提供了科学依据。