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TIP30,又称CC3,是一个在人体各组织广泛表达的保守基因,被认为是一个抑癌基因,又可特异性地提高HIV-1增殖调节蛋白Tat的转录.文昌鱼(Amphioxus)是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型,是研究脊椎动物进化的珍贵材料.利用分子生物学手段和生物信息学方法,研究文昌鱼TIP30基因的结构、表达和进化,可以揭示文昌鱼TIP30基因与无脊椎动物和脊椎动物TIP30基因之间的相互关系,有助于我们从分子水平上来了解脊椎动物的起源与进化.本文对TIP30基因的克隆、表达及进化方面进行了研究.
首先利用RT-PCR和RACE等方法克隆了青岛文昌鱼TIP30基因,AmphiTIP30.AmphiTIP30的全长eDNA序列为1499bp,包含一个822 bp的开放阅读框(ORF),在5端有两个起始密码子(ATG):第一个ATG编码一个23个氨基酸组成的信号肽;第二个ATG所编码的蛋白质为成熟蛋白,由237个氨基酸组成,其分子量大约为26 KDa.该蛋白在氨基酸水平上与菌类的相似性为21.3-28.7﹪,与无脊椎动物的相似性为17.3-41.3﹪,与硬骨鱼的相似性为53.2﹪,与两栖类的相似性为49.8﹪,与哺乳动物的相似性为50.6-51.9﹪,且具有TiP30的特征基序:ATP结合基序(GrXXGXXG)和一个典型的TIP30保守结构,在相同的位置含有人等TIP30蛋白共有的3个典型的氨基酸残基(Ser166,Tyr177 and Lys181,序号为人TIP30).在所构建的进化树中,文昌鱼的TIP30蛋白位于脊椎动物分枝的基部,脊椎动物和无脊椎动物各自聚群,支持了在系统进化上文昌鱼是脊椎动物起源动物的观点,也进一步证明AmphiTIP30是脊椎动物和无脊椎动物TIP30蛋白的同源物.Northern杂交和切片原位杂交表明,TiP30基因在文昌鱼中主要表达于卵巢组织利用原核表达并纯化了文昌鱼TIP30蛋白,获得了分子量约为29KDa的纯化蛋白.生化试验证明其对NADPH具有较大的结合常数,并具有还原酶活性;使用成品TIP30多克隆抗体进行Western杂交结果表明,抗体能与本研究的纯化蛋白AmphiTIP30特异性杂交.另外,免疫组化结果表明,TIP30在文昌鱼主要分布在卵巢组织,与切片原位结果一致,这似乎预示着TIP30与卵巢的发育有关联.