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目的:乳腺癌是现代女性最常见的恶性肿瘤之一。在中国,乳腺癌的发病率在近几十年来不断增高,死亡率居高不下,并呈年轻化的趋势。最近的几十年间,研究者对于基因治疗在肿瘤、遗传性疾病、血液疾病、感染性疾病等领域的应用开展了广泛研究,有些已在疾病的治疗中取得显著疗效。在肿瘤的治疗领域,基因治疗因其可能根除恶性肿瘤的原发灶、转移灶而同时不伤及正常组织的特点而受到广泛的关注。果蝇多底物脱氧核苷激酶(multisubstrate deoxyribonucleoside kinase of Drosophila melanogaster,Dm-dNK)是一种高效的核苷酸激酶,其催化效率比普通的核苷酸激酶高10-100倍,且具有极其广泛的底物特异性,能够催化自然界全部脱氧核糖核酸的磷酸化反应。目前,作为一种自杀基因,Dm-dNK被用于多种恶性肿瘤细胞中,除了能够直接将其杀伤外,还可以通过旁观者效应间接杀伤肿瘤细胞。我们在前期研究中已经证实,Dm-dNK所产生的激酶能够对核苷类似物(nucleoside analog)等抗肿瘤药物起到有效的磷酸化作用。此外,在肿瘤细胞系中,Dm-dNK的表达还能够显著提高肿瘤细胞对多种化疗药物的敏感性。但是,该自杀基因体系是否可以在原代培养的肿瘤细胞中正常发挥杀伤作用尚无报道。为此,本研究构建了携带自杀基因Dm-dNK的选择复制型腺病毒,并对该系统对乳腺癌原代细胞的杀伤作用进行了探索性研究,从而为乳腺癌的治疗提供新的思路。方法:选取2017-06-01至2018-06-01期间,就诊于中国医科大学附属第一医院乳腺外科二病区的63例经手术切除的原发性乳腺癌患者的新鲜肿瘤组织。通过肿瘤细胞的三维立体培养技术对外科手术切除的肿瘤标本进行原代细胞培养(n=63)。加入不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)的重组腺病毒AdGFP,荧光显微镜下计数绿色荧光蛋白(GFP)的阳性细胞百分比,验证病毒转染效率。构建溶瘤腺病毒载体SG500-Dm-dNK,利用western blot验证相关蛋白表达。使用MOI=1,MOI=10,MOI=20的SG500及SG500-dNK分别感染肿瘤细胞培养48h;使用浓度为1μM,10μM及100μM的吉西他滨(Gemcitabine,DFDC)分别加入肿瘤细胞培养72h;使用MOI=10的SG500和SG500-dNK感染肿瘤细胞培养48h后,再分别加入上述浓度的DFDC培养72h。使用Primage图像分析系统测量上述3组不同处理后的肿瘤细胞存活率。结果:1.携带GFP的选择复制型腺病毒感染人乳腺癌原代细胞后,在荧光显微镜下可观察到发出荧光的肿瘤细胞,且感染效率随MOI升高而提高。2.Western blot对对照组、SG500-dNK组及SG500组的检测发现,SG500携带的Dm-dNK能够在乳腺癌原代细胞中表达相关蛋白产物。3.在MOI=1和MOI=10时,SG500-dNK单独应用于乳腺癌原代细胞的细胞杀伤作用与单独应用空载体对细胞的杀伤作用无显著性差异(p>0.05);MOI=20时,SG500-dNK的细胞杀伤作用高于SG500(p<0.05)。4.在DFDC浓度相同时,SG500-dNK与DFDC联合应用对乳腺癌原代细胞的杀伤作用显著高于SG500与DFDC联用以及单用DFDC,并随着DFDC浓度的逐步提高而更加明显(均p<0.05)。结论:第一,选择复制型腺病毒SG500携带的外源基因可以转染胶滴中的乳腺癌原代细胞并表达相关蛋白产物。第二,在乳腺癌原代细胞中,Dm-dNK与DFDC联合应用较两者单独应用能更有效的杀伤肿瘤细胞,发挥其抗肿瘤作用,为Dm-dNK/DFDC自杀基因治疗乳腺癌的进一步临床研究和应用提供了有力证据。