论文部分内容阅读
沙门菌(SalmoneHa)是重要的人兽共患病病原菌,可导致多种动物和人的沙门菌病,能引发胃肠炎、伤寒和败血症等多种症状,不仅给禽畜养殖业造成重大损失,也严重威胁人类食品安全。CigR蛋白作为沙门菌中广泛分布的假定抗毒力蛋白,且为T3SS-2效应蛋白,在沙门菌持续感染过程中发挥重要作用。国内外学者对沙门菌CigR蛋白的研究相对匮乏,仍有待于揭示其分子作用机制。本研究主要对沙门菌CigR蛋白对毒力的抑制及其在细菌中的定位展开了相关研究。通过λ-Red同源重组成功构建了鼠伤寒沙门菌cidR基因缺失株,通过系列动物实验充分证实沙门菌的cigR基因具有抑制毒力的功能。在细胞感染水平证实沙门菌CigR蛋白能降低其形成SCV的能力。多序列比对结果显示鸡沙门菌中CigR蛋白信号肽均存在部分片段缺失,但并未造成CigR蛋白胞内定位变化,且证实体外培养状态下CigR蛋白的表达不受T3SS调控。1.鼠伤寒沙门菌CigR蛋白对毒力的抑制本研究利用λ-Red同源重组成功构建了缺失株SL1344△cigiR和回补株SL1344△cigiR-pcigR。测定了它们同野生株SL1344对BALB/c小鼠的LD50,缺失株LD50下降了 24.15倍;小鼠存活曲线实验证明,同等菌量下,缺失株感染组BALB/c小鼠存活率下降50%。缺失株与野生株在BALB/c小鼠脾脏内竞争实验证明,cigR基因缺失后鼠伤寒沙门菌竞争能力增强,且竞争优势在感染第6天达到峰值,随后竞争优势减弱。BALB/c小鼠体内脏器载菌量实验结果显示,三株菌在肝脏和脾脏中载菌量和存活时间无明显差异;在回肠和盲肠中,SL1344△cigR感染组较SL1344感染组提前出现载菌量峰值,SL1344△cigR感染组回肠载菌量在6 d和12 d(显著性差异)高于SL1344感染组。SL1344△cigR感染组盲肠载菌量在3 d(显著性差异)、6 d和12 d(显著性差异)高于SL1344感染组。SL1344△cigR侵入派尔氏结的时间明显早于SL1344,且SL1344△cigR在感染后6 d内的载菌量均高于其它两株菌。BALB/c小鼠体内脏器组织切片实验发现,肝脏中3d时缺失株感染组首先出现淋巴细胞,在6d、9 d和12 d时,缺失株感染组炎症反应较其它两组明显。脾脏和回肠中三株细菌感染组炎症反应虽有差异,但并不明显。盲肠中SL1344△cigR-pcigR引起炎症情况与其它两组相比相对较轻。在派尔氏结中,3d时缺失株率先出现了淋巴细胞,在6 d时,缺失株感染组的炎症反应明显强于其它两组。2.鼠伤寒沙门菌CigR蛋白抑制SCV的形成本研究通过SL1344、SL1344△cigR和SL1344△cigR-pcigR对人结肠癌上皮细胞系Caco2-BBE和小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的侵染实验发现cigR基因的缺失不影响鼠伤寒沙门菌对上皮细胞和巨噬细胞的黏附侵袭能力及细菌在胞内的增殖趋势。在感染Caco2-BBE的增殖实验中,5 h、8 h、16 h和20 h时,SL1344△cigR增殖倍数均高于SL1344和SL1344△cigR-pcigR,且5 h、8 h和20 h达到显著性差异。在感染RAW264.7的增殖实验中,5 h、8 h和16 h时,SL1344△cigR的增殖倍数均高于SL1344和SL1344△cigR-pcigR,且均达到极显著差异。实验证实cigR基因的缺失提高了鼠伤寒沙门菌在上皮细胞和巨噬细胞中的增殖能力。因沙门菌在含沙门菌囊泡(Salmonella-containing vacuole,SCV)中增殖,为探究CigR蛋白是否影响沙门菌SCV形成能力,本研究成功构建了可表达GFP、自带绿色荧光的重组菌 SL1344(pYA3334-GFP)、SL1344△cigR(pYA3334-GFP)和SL1344AcigR-pcigR(pYA3334-GFP),并选择Rab7蛋白作为SCV的标记蛋白,用激光共聚焦显微镜分别观察三株荧光细菌在Caco2-BBE和RAW264.7中SCV内的增殖情况。在 Caco2-BBE 细胞中,细菌感染 16 h 时,SL1344△cigR(pYA3334-GFP)募集 Rab7 蛋白的能力明显强于其它两株细菌。在各个时间点,SL1344△cigR(pYA3334-GFP)感染组中SCV的数量占比均高于其它两株细菌感染组。在RAW264.7中,细菌感染5 h、16 h时,SL1344△cigR(pYA3334-GFP)招募Rab7蛋白的能力显著强于其它两株细菌。各时间点SL1344△cigR(pYA3334-GFP)形成SCV的数量占比均高于其他两株细菌,且呈现极显著差异。说明CigR蛋白能降低鼠伤寒沙门菌在上皮细胞和巨噬细胞中形成SCV的能力。3.沙门菌CigR蛋白的亚细胞定位及其调控机制研究本研究对已公布的沙门菌序列及本实验室测序获得的所有鸡沙门菌(含鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌)序列中的cigR基因进行序列比对,结果显示所有鸡沙门菌在CigR蛋白信号肽均存在14个氨基酸位点的缺失。利用质粒pBR322成功构建了带FLag标签的两种CigR蛋白表达质粒,并分别导入SL1344△cigR和C79-13△cigR中。Werstern blot实验显示部分信号肽序列的缺失并不影响CigR蛋白定位于细胞内膜,且不影响其在内膜中的表达量。将质粒分别导入鸡白痢沙门菌S06004、S06004△SPI-1、S06004△SPI-2中。Werstern blot实验显示在体外培养状态下CigR蛋白的表达并不受T3SS的调控。