神经系统损伤及神经退行性疾病所造成的神经功能缺损一直是困扰人类健康的难题,也是神经科学领域研究的焦点和热点。长期以来的研究表明,神经细胞本身缺乏再生能力。迄今为止,已有的药物治疗只是对症治疗,而不能从根本上解决神经细胞缺失的问题,更无法治愈该类疾病。干细胞在特定微环境条件下,能够被诱导分化成为多种组织细胞,通过移植给受者参与组织的再生与修复,为临床医学提供了一个新的充满希望的治疗手段,可用于治疗修复一些曾经被人类认为是不可再生的组织器官。干细胞技术的不断发展,为治疗甚至治愈神经损伤及神经退行性疾病提供了可能。目前研究较多的干细胞类型包括胚胎干细胞、神经干细胞、间充质干细胞。间充质干细胞相对于其他干细胞,如胚胎干细胞和神经干细胞等具有多方面的优势,因此备受关注。多项研究表明,间充质干细胞对神经退行性疾病、神经免疫性疾病、神经系统损伤性疾病和脑血管疾病都有积极的治疗意义。脐带由于具有采集方便,免疫原性低,病毒污染率低,不涉及社会、伦理及法律方面争议等优点,可以作为间充质干细胞的理想来源。目前,脐带间充质干细胞体外神经分化的方法主要有化学试剂和神经营养因子诱导法,但化学试剂如丁基羟基苯甲醚,二甲亚砜、β-巯基乙醇等或多或少对细胞都会产生细胞毒性；而细胞因子bFGF、EGF、BDNF等由于是大分子蛋白质不易通过血脑屏障,因此限制了它们进一步应用于临床。神经甾体(neurosteroids)是一类由神经系统的神经元或神经胶质细胞合成、代谢产生的具有神经活性甾类物质的总称,主要包括孕烯醇酮(pregnenolone, PREG)、孕酮(progesterone, PROG)及别孕烯醇酮(allopregnanolone, AP)等。大量研究显示,神经甾体不仅参与调节神经系统的发育并对神经系统的功能产生影响；对神经系统具有营养、保护以及促进神经发生和神经元存活作用；同时,神经甾体作为小分子物质易通过血脑屏障而发挥作用。已有文献报道,孕酮及其代谢物别孕烯醇酮促进干细胞的增殖与分化。目的：采用组织块法培养人脐带间充质干细胞,通过应用含脑组织的培养液来模拟脑内微环境,考察脐带间充质干细胞是否具有向神经细胞分化的能力。在此基础上,采用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)方法对细胞分化过程中主要神经甾体的合成代谢水平的变化进行研究。随后,探讨其中具有作用潜力的孕酮在模拟脑内微环境中对脐带间充质干细胞定向分化为神经细胞的影响,并进一步探讨其作用机制,以期为临床治疗神经损伤和神经变性病提供新的思路和依据。方法：1人脐带间充质干细胞的分离纯化及生物学特性取足月、健康的顺产胎儿脐带,PBS冲洗,剥除动、静脉血管,分离获得wharton’s jelly (华尔通)胶,充分剪碎至约1mm3大小,置于含有10%胎牛血清(FBS),100U/mL青霉素,100U/mL链霉素的DMEM/F12培养基中,在体积分数为5%的CO2培养箱中37℃培养。培养获得人脐带间充质干细胞(hUMSCs),传代、纯化、扩增。倒置显微镜下观察细胞形态变化。取生长状态良好的第3代hUMSCs,用0.25%的胰酶/EDTA消化,制成单细胞悬液,分别加入抗人的HLA-DR-FITC、CD34-PE. CD45-PC5、CD29-FITC和CD105-PE单克隆抗体,流式细胞术检测细胞表面标志物。将生长状态良好的第3代hUMSCs以2×104/孔的密度接种在6孔板内,以DMEM/F12含10%FBS,10-6M地塞米松,50mg/L抗坏血酸,100mg/L1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤,100U/ml青霉素和100U/mL链霉素对hUMSCs进行成脂诱导。以DMEM/F12含10%FBS,50mg/L抗坏血酸,10-8M地塞米松,10mmol/Lp-甘油磷酸,100U/mL青霉素和100U/mL链霉素对hUMSCs进行成骨诱导。14d后,采用油红O染色检测脂肪滴,用VonKossa染色检测钙化基质沉淀。2脑组织微环境对hUMSCs分化的影响SD雄性大鼠断头取出脑组织,置于冰上,称取湿重,按150g/L加入DMEM/F12培养基,用匀浆器在冰浴中将脑组织匀浆,低温高速离心(5000g,10min)后吸取上清液,得到含脑组织的培养液(脑组织匀浆上清)。将培养的第3代hUMSCs制成单细胞悬液,以1×105/mL的细胞密度接种于24孔板中,制备细胞爬片,孔内预先铺有经多聚赖氨酸处理的盖玻片,待细胞贴壁伸展后加入诱导液(脑组织匀浆上清+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素),倒置显微镜下观察细胞形态变化。于培养后的第3d,取出盖玻片进行免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞标志物nestin,神经元表面标志物NSE及胶质细胞表面标志物GFAP的表达,并进行甲苯胺兰染色鉴定尼氏体。3hUMSCs在脑组织微环境分化过程中主要神经甾体及3β-HSD的变化将培养的生长状态良好的第3代hUMSCs制成单细胞悬液,调整细胞密度以1×105/mL的细胞密度接种于24孔板中,待细胞贴壁伸展后去掉培养基,进行诱导培养。分为对照组(DMEM/F12+10%FBS)和脑组织匀浆上清组。分别于培养的0、1、3、7d收集细胞培养液,1000r·min-1离心5min,收集上清液,用乙酸乙酯/正己烷萃取,以固相萃取法进行纯化,加入内标甲睾酮,样品和标准品与2-硝基-4-三氟甲基苯肼(2-nitro-4-trifluoromethyphenylhydrazine,2NFPH)衍生化,采用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术测定孕烯醇酮(PREG)、孕酮(PROG)和别孕烯醇酮(AP)的含量。采用免疫细胞化学染色法检测3β-羟基甾醇脱氢酶(3β-HSD)的表达变化。4孕酮在脑组织微环境中对hUMSCs分化的影响取生长状态良好的第3代hUMSCs,按1×106/孔密度接种于6孔板。待细胞贴壁伸展后去掉培养基,进行诱导培养。对照组培养基为脑组织匀浆上清,实验组在脑组织匀浆上清中加入不同浓度的PROG,使终浓度分别为0.1μM、1μM、10μM。在倒置显微镜下观察细胞的形态变化。培养3d后,RT-PCR检测细胞NSE表达情况。在RT-PCR得到PROG促进分化的最佳浓度的基础上,进一步应用流式细胞术对分化后细胞NSE、nestin、GFAP的表达进行检测。5孕酮对hUMSCs分化过程中BDNF水平的影响取生长状态良好的第3代hUMSCs,1×105/mL的密度种植于24孔板中,待细胞伸展后,弃去培养基,加入诱导培养基。分为①对照组：DMEM/F12+10%FBS;②脑组织匀浆上清组；(DPROG (1μM)+脑组织匀浆上清组。分别于培养后的0、1、3、7d收取培养液,1000r·min-1,离心,取上清,用酶联免疫法测检脑源性神经营养因子(BDNF)的水平。结果：1hUMSCs的培养与鉴定人脐带wharton’s jelly胶组织块培养约3-5d后,倒置显微镜下可见组织块间隙散在分布的长条索状纺锤型细胞,2w左右细胞达到80-90%融合,呈放射状或漩涡状分布。经传代培养后细胞增殖迅速,可得到纯化的成纤维样细胞,细胞约4-5d即可达到80%-90%融合。流式细胞仪检测人脐带间充质干细胞高表达CD29、CD44、CD105等间充质干细胞标志,不表达CD34、CD45等造血细胞标志和人类白细胞抗原HLA-DR。以成脂培养基诱导培养14d后,大部分细胞转变为扁平、肥大、内含大量可被油红着色的多角形脂肪细胞；以成骨分化方案诱导培养14d后,细胞逐渐转变为多角形或不规则形,可见VonKossa染色阳性细胞。2hUMSCs在模拟脑内微环境中向神经细胞分化hUMSCs在脑组织匀浆上清中培养约12h后,细胞形态即发生变化,细胞质向核收缩,胞体变小,呈不规则形或圆形。培养72h,部分细胞可见两个或多个突起伸出,类似神经细胞,有些细胞呈简单的双极或多极,细胞之间有简单的交联。经免疫细胞化学染色后在镜下可观察到：多数细胞分别呈nestin、NSE及GFAP阳性表达。甲苯胺蓝染色后镜下可观察到胞质中存在着深蓝色颗粒状的尼氏小体。3hUMSCs在模拟脑内微环境中向神经细胞分化过程中主要神经甾体及3β-HSD的变化在基础培养基组,PROG浓度低于最低定量限。脑匀浆上清培养组细胞培养上清液中PROG的含量随着培养时间的延长显著升高,0d：1.78±0.50ng/mL；1d：2.88±0.29ng/mL；3d：7.51±0.65ng/mL；7d：10.56±0.65ng/mL,差异显著(P<0.05)。基础培养基中可检测到PREG,随着hUMSCs培养时间的延长,PREG水平未见显著变化(P>0.05)；在脑组织匀浆上清中可检测到PREG,随着hUMSCs培养时间的延长,PREG水平逐渐降低,0d：14.74±0.63ng／mL；ld：12.34±0.56ng／mL；3d：10.62±0.32ng／mL；7d：8.61±0.50ng／mL,差异显著(P<0.05)。基础培养基与脑组织匀浆上清培养组的AP浓度均低于最低定量限。与对照组相比,hUMSCs在脑匀浆上清中培养的细胞中显示3β-HSD表达,且随着培养时间的增加,表达增强。4孕酮在体外模拟脑内微环境中对hUMSCs向神经细胞分化的影响PROG处理后,hUMSCs的形态与单纯脑组织匀浆上清培养相比变化更加明显,神经细胞的特征形态出现的时间更早,并且细胞之间发生明显的交联。RT-PCR结果显示,与含脑组织匀浆上清培养液培养相比,加入PROG处理后可促进hUMSCs向神经元分化,且1μM为最适宜浓度。流式细胞术进一步检测了1μMPROG处理3d后细胞NSE、nestin、GFAP的表达,结果显示,1μMPROG处理组中NSE表达显著高于对照组,58.40±8.22%vs22.15±1.41%(P<0.05),nestin表达显著低于对照组,24.60±2.86%vs35.07±1.95%(P<0.05),GFAP表达无显著性差异,8.0±1.05%vs7.07±0.64%(P>0.05)。5孕酮对hUMSCs向神经细胞分化过程时微环境中BDNF水平的影响与对照组相比,脑匀浆上清培养组与PROG处理组中细胞培养上清液中BDNF的浓度均显著升高(P<0.05),而PROG处理后BDNF的浓度与单纯脑匀浆上清培养相比也有显著升高(P<0.05)。结论：1应用组织块贴壁培养法能够从脐带wharton’s jelly胶中培养出大量增殖能力较强、具有多向分化能力的成纤维样细胞,其高表达间充质细胞标志,不表达造血细胞标志和人类白细胞抗原,证实了脐带可作为MSCs的重要来源。2hUMSCs在脑组织微环境下培养,显示神经细胞形态。分化后的细胞经nestin、GFAP及NSE免疫染色和尼氏体染色均表达阳性,提示,hUMSCs在脑组织微环境中分化为神经细胞,其分化方式可能是先分化为神经干细胞再向神经元或神经胶质细胞分化。3在脑组织微环境培养hUMSCs过程中,PROG随着培养时间的延长,生成显著增多,PREG水平显著降低。说明分化后细胞能够合成、分泌神经甾体,具有功能性神经细胞的特性。同时提示PROG可能在脑组织微环境促进hUMSCs(?)神经分化过程中扮演了角色。4PROG处理可以提高hUMSCs在脑组织微环境中的神经分化速度,并且促进hUMSCs向神经元方向分化,这对该类干细胞移植用于相关神经系统疾病的治疗具有重要意义。5脑组织微环境及其中的PROG可显著增加分化中的hUMSCs合成BDNF的能力。对BDNF的调节可能是微环境及PROG促进hUMSCs神经分化的机制之一。