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研究背景和目的宫腔粘连(IUA)是创伤、感染等因素引起的子宫内膜纤维化。主要病理改变是炎症及细胞外基质纤维蛋白原的聚集。宫腔粘连是世界难题,中重度IUA严重着影响患者的生育功能及生殖健康。转化生长因子TGF-β1被公认为是纤维化的启动因子,且在IUA中高表达。叉头框转录因子F2(FOXF2)是间质特异性转录因子,参与细胞外基质的合成、上皮与间质之间的相互转化等。越来越多与纤维化疾病相关的长链非编码RNA(LncRNA)被发现,且Wnt/β-catenin信号通路在纤维化疾病中处于激活状态,其作用机制正逐渐被证实及阐明,相关的LncRNA及FOXF2在宫腔粘连中的作用及机制尚未被揭示。本研究通过基因芯片-seq(高通量测序)、染色体免疫共沉淀(ChIP)-seq、RNA-蛋白质复合物免疫共沉淀(RIP)-seq及生物信息分析,进一步探讨宫腔粘连细胞模型中LncRNA、FOXF2及Wnt/β-catenin信号通路的作用及其机制,为其防治子宫内膜纤维化提供理论依据。方法与结果1.TGF-β1诱导原代人子宫内膜基质细胞纤维化中FOXF2及COL5a2的表达方法:利用基因芯片-seq分析临床宫腔粘连组及正常组子宫内膜组织,筛选差异蛋白;TGF-β1诱导原代人子宫内膜基质细胞(HESCs)构建宫腔粘连细胞模型,qRT-PCR及WB法检测HESCs中纤维化标记物(α-SMA、COL1A1、COL5A2)以及FOXF2mRNA和蛋白的表达,免疫荧光(IF)检测纤维化标记物、FOXF2的定位及表达;流式检测细胞周期及凋亡。结果:基因芯片-seq得出宫腔粘连组FOXF2基因高表达;TGF-β1诱导下HESCs发生肌成纤维细胞样改变,且上调纤维化标记物以及FOXF2的表达,促进胶原蛋白的分泌、细胞外基质的沉积和细胞的增殖。2.siRNAFOXF2通过下调cyclinD2/CDK4、胶原蛋白的表达抑制TGF-β1诱导HESCs纤维化方法:ChIP-seq寻找FOXF2下游靶基因及信号通路;在TGF-β1作用HESCs前后分别沉默FOXF2,对应为宫腔粘连细胞模型预防组及治疗组,qRT-PCR及WB法检测HESCs中纤维化标记物、FOXF2及靶基因的表达;IF检测纤维化标记物、β-catenin、FOXF2的定位及表达;CCK-8及EdU检测细胞增殖能力;流式检测细胞周期。结果:ChIP-seq 得出 FOXF2 下游靶基因:COL1A1、Vimentin、COL5A2、CyclinD2及CDK4等;沉默FOXF2可下调纤维化标记物、FOXF2下游靶基因、p-GSK3的表达,且使β-catenin及FOXF2的细胞核内积聚的现象减少,抑制细胞的增殖,细胞阻滞在G0/G1期。3.siRNA SNHG5通过下调FOXF2及Wnt/β-catenin信号通路改善TGF-β1诱导HESCs纤维化方法:RIP-seq寻找FOXF2结合的LncRNA;构建LncRNA探针,RNA Pull-down银染及WB证实FOXF2与LncRNA结合;FISH及核质分离检测LncRNA的定位;分别下调及上调LncRNA与FOXF2基因,验证二者调控关系;在TGF-β1作用HESCs前后分别沉默LncRNA,对应为预防组及治疗组,qRT-PCR及WB法检测HESCs中纤维化标记物、FOXF2及靶基因的表达;IF检测β-catenin、FOXF2的定位及表达;流式检测细胞周期。结果:RIP-seq筛选出LncRNA SNHG5,证实其与FOXF2存在结合位点,并正向调控FOXF2;SNHG5胞质及核内均有表达,主要表达于核内;沉默SNHG5可下调纤维化标记物、FOXF2及靶基因mRNA的表达,下调Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白的表达,抑制细胞增殖,使细胞阻滞在G0/G1期。结论:利用基因芯片-seq、ChIP-seq、RIP-seq及生物信息分析,得出LncRNA SNHG5、FOXF2及下游靶基因、Wnt/β-catenin信号通路参与宫腔粘连发生的过程。长链非编码 RNA SNHG5 与 FOXF2 通过SNHG5-p-GSK3-β-catenin-CyclinD2/CDK4 和 SNHG5-FOXF2-CyclinD2/CDK4 途径,且二者构成环状结构,共同调控TGF-β1诱导原代人子宫内膜基质细胞纤维化的重要机制,是防治宫腔粘连中子宫内膜纤维化的潜在靶点。