论文部分内容阅读
单核苷酸多态性是人类基因组中最常见的变异，与人体相关表型差异和疾病的易感性存在一定的相关性，作为第三代遗传标记技术已经广泛应用于风险人群的发现、疾病易感基因识别与诊断、药物设计与检测等临床研究中。SNP检测具有位点数量多、多态性丰富等特点。目前SNP的检测手段众多，DNA微阵列芯片作为SNP分析的最主要手段具有高通量、快速、准确检测等优点。本文以金沉积增强的共振光散射DNA微阵列芯片为反应平台，发展一种灵敏度高、选择性好的SNP检测方法。主要内容如下: 1、溶液体系中，应用种子生长法，以DNA功能化的金纳米粒子(GNP)作为金种，使用H2O2还原HAuCl4溶液方法进行金增长。通过透射电子显微镜，紫外可见吸收光谱等表征手段对金增长溶液各组分浓度进行优化。实验结果表明，液相中H2O2浓度为0.1M，HAuCl4为0.2mM时，金沉积1min后即可以使粒子大小为13nm的GNP增长成为较稳定、形貌较好的大尺寸的金纳米粒子。 2、以DNA功能化的GNP为探针构建DNA微阵列芯片体系，应用金沉积增强的共振光散射(RLS)方法对四种SNPs进行分析与检测。首先根据上述液相金增长体系进行芯片上金沉积反应条件优化，在优化条件下对四种SNP进行线性检测及等位基因频率的分析，验证方法可行性。该方法线性范围可达3-4个数量级，最低检出限为10pM，具有较好的选择性和较高的灵敏度。 3、上述芯片体系应用于实际样品乳腺癌易感基因的研究。选择乳腺癌细胞(MCF-7)、正常人肝细胞(HL-7702)及宫颈癌细胞(HeLa)三种细胞系，通过聚合酶链反应扩增细胞基因组DNA中四个SNP位点序列，扩增后产物作为目标物直接进行分析检测。结果显示，该方法可应用于微量的实际样品检测，同时具有选择性优良、稳定性好、灵敏度和精确度高等优点，具有一定的临床价值。