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脑梗死（cerebral infarction）是一种具有高发病率与高致残率的脑血管疾病。其主要病理是血栓堵塞血管导致的神经细胞缺血性死亡，对其最有效的疗法是溶栓治疗以恢复缺血组织的血供，但会造成脑缺血-再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤。缺血后处理（ischemic postconditioning，IPostC）是一种在组织器官发生缺血损伤后，再灌注恢复之前，给予多次短暂交替的亚致死性缺血与再灌注的处理方式。已经在一些实验与临床中证实它具有抗I/R损伤的作用，并且IPostC在再灌注前施行，可操作性好。现有的研究认为，IPostC发挥作用的主要靶点是细胞凋亡与PI3K/Akt信号通路，但其具体机制仍未阐明。目前，IPostC对脑I/R损伤影响的研究较少，多以动物模型为研究对象，对其在体外细胞模型中的作用及机制研究很少。本研究拟通过使用体外培养的SK-N-SH细胞，改进建立氧糖剥夺-再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）损伤的细胞模型，以模拟体内I/R损伤，同时通过短暂交替的氧糖剥夺与复氧糖的处理方式实施氧糖剥夺后处理（oxygen-glucose deprivation postconditioning，OGDP）以模拟IPostC，观察OGDP对OGD/R的影响及其影响因素。在此基础上，选择OGDP的最适处理方式，进一步探讨OGDP抗OGD/R损伤的机制，为在体外研究脑I/R损伤的机制与治疗靶点提供可靠的实验基础。本研究内容分为两个部分：（1）氧糖剥夺后处理在氧糖剥夺-再灌注中的保护作用。（2）氧糖剥夺后处理对氧糖剥夺-再灌注细胞凋亡的作用及可能机制。第一部分氧糖剥夺后处理在氧糖剥夺-再灌注中的保护作用目的：观察OGDP在OGD/R中的保护作用及其影响因素。方法：应用SK-N-SH细胞进行OGD4h，然后恢复氧糖20h而建立OGD/R模型，并在细胞OGD后实施OGDP。细胞分为对照组（正常培养组）、氧糖剥夺-再灌注组（OGD/R组）与氧糖剥夺后处理组（OGDP组），其中OGDP组根据OGDP的不同处理时间分为1、5、10、15、20、30、60min亚组；根据不同时间窗分为5、10、15、20、30、60min亚组；根据不同循环次数分为1、2、3、4、5、6次循环亚组。MTT比色法检测不同处理组的细胞存活率，倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化。结果：（1）OGDP不同处理时间对细胞存活率的影响OGD/R组细胞存活率比对照组下降约44.5%（P<0.01）。与OGD/R组相比，10、15min组细胞存活率的增加有统计学意义（P<0.01），其中10min组细胞存活率约比OGD/R组提高约15.7%，并与15min组比较无差别（P>0.05）。20、30、60min组的细胞存活率呈下降趋势，并且不能提高存活率（与OGD/R组比较，P>0.05）。（2）OGDP不同时间窗对细胞存活率的影响。与OGD/R组相比，时间窗10、15min组能显著提高损伤细胞的存活率（P<0.01），而5、20、30、60min组则不能提高细胞存活率（P>0.05）。（3）OGDP不同循环次数对细胞存活率的影响。与OGD/R组比较，1、2、3、4次循环组细胞存活率显著增加（P<0.01），与1次循环组相比，3次循环组细胞存活率显著增加，提高了约8.5%（P=0.02），而2、4次循环组细胞存活率无显著提高（P>0.05）。（4）倒置相差显微镜下细胞形态学观察对照组细胞数量多，呈不规则贴壁生长，胞体饱满呈锥形或多边形，边界清楚有明显的光晕，有很强的折光性，突起粗而长。OGD/R组细胞数量明显减少，细胞稀疏，折光性下降，贴壁性差，突起回缩，胞体明显皱缩变小变圆。与OGD/R组相比，OGDP组细胞数量显著增多，多数形态正常，贴壁状态较好，折光性上升，胞体多呈多边形，少数细胞胞体皱缩变圆。结论：OGDP对OGD/R损伤细胞的具有保护作用，其作用与OGDP的处理时间、时间窗及循环次数有关，并且在3次循环的10min后处理时效果显著。第二部分氧糖剥夺后处理对氧糖剥夺-再灌注细胞凋亡的作用及可能机制目的：观察OGDP在OGD/R中的抗细胞凋亡作用，并寻找其抑制凋亡的可能机制，探讨PI3K/Akt信号通路在OGDP抗OGD/R细胞凋亡中的作用。方法：模型制作及OGDP方式同第1章。细胞实验分为对照组（正常培养组）、氧糖剥夺-再灌注组（OGD/R组）、氧糖剥夺后处理组（OGDP组）。Hoehst33258凋亡染色观察凋亡形态学的变化并进行凋亡计数，Western blot法检测蛋白Caspase-3、p-Akt和Akt的表达。结果：（1）Hoechst33258检测结果对照组细胞核荧光颜色呈均匀淡蓝色，细胞核形态规则。OGD/R组细胞核发高亮的蓝色荧光，核有破碎，染色质固缩和边集化，呈凋亡特征。OGDP组较OGD/R组细胞核荧光颜色明显变淡，细胞核形态趋于规则，染色质固缩减少。凋亡计数结果显示，OGD/R组与OGDP组细胞凋亡率与对照组相比显著增高（P<0.01），OGDP组细胞凋亡率显著低于OGD/R组（P=0.023）。（2）Western blot检测Akt、p-Akt表达的结果各组间Akt蛋白表达量差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组相比，OGD/R组与OGDP组p-Akt蛋白表达水平显著增加（P<0.01）。与OGD/R组比较，OGDP组p-Akt表达水平显著增加（P=0.04）。（3）Western blot检测caspase-3表达的结果与对照组相比，OGD/R组与OGDP组caspase-3蛋白表达水平明显增高（P<0.01），但与OGD/R组相比，OGDP组caspase-3表达水平显著下降（P=0.02）。结论：OGDP具有抑制OGD/R中细胞凋亡的作用，其抑制凋亡作用可能与caspase-3表达受抑制有关，并且PI3K/Akt信号通路参与OGDP抑制细胞凋亡的过程。