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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是生命过程中通用的氧化还原辅酶和重要的小分子。创制人工辅酶，实现对目标氧化还原过程的选择性调控，对系统生物学和合成生物学研究具有重要意义。本论文以NAD+依赖型苹果酸酶(ME)为模型，研究构建可特异性利用NAD+类似物为辅酶催化L-苹果酸氧化脱羧反应的新体系，并尝试验证该策略的通用性。
首先，设计并合成了11个焦磷酸型NAD+类似物，反应规模达到克级。
其次，以ME为模型，在结构生物学指导下构建了5个双位点饱和突变文库。利用NAD+类似物和突变文库进行交叉筛选，获得15个特异性识别烟酰胺5-氟胞嘧啶二核苷酸(NFCD+)的突变酶。其中，MEL310R/Q401C对NFCD+的kcat/Km是96.7mM-1s-1，与野生型ME对NAD+的Kcat/Km值214.8mM-1s-1接近，说明该生物正交体系具有与天然体系相当的催化效率。
第三，获得了不同NAD+类似物与ME突变酶的功能配对，并将ME突变规律移植到乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶，在保守位点进行定点突变，均获得了相应的NFCD+偏好性突变酶，说明构建生物正交氧化还原体系的策略可以推广。
第四，利用双酶偶联法实现了NFCD+的循环再生，并发现仅供给人工辅酶NFCD+时，含MEL310R/Q401C的细胞裂解液转化L-苹果酸只得到丙酮酸，无副产物乳酸，初步表明生物正交氧化还原体系具有特定的实际应用潜力。