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抗菌肽具有广谱的抗菌活性，成为宿主先天免疫的重要组成部分。因其具有抗菌活性强、抗菌谱广、耐热性好、不易产生耐药性等优点而深受人们的关注。ORTAP40是从中国美利奴绵羊生殖道分离的一种新型的阳离子抗菌肽，在早期的防御中起到了重要的作用。
本研究根据ORTAP40 N端氨基酸序列设计引物，利用3RACE技术克隆了绵羊生殖道抗菌肽3末端全长cDNA序列，并将其克隆之pMD18-T载体，进行序列测定，将测序鉴定正确的载体质粒命名为pMD18-T-ORTAP40，并登陆GenBank，登录号为FJ514476，经过cDNA序列分析显示，ORTAP40是一个4.8kD的小肽，与分离纯化的分子量一致。为得到大量抗菌肽纯品，进一步研究其生物学活性，首先，参照毕赤巴斯德酵母（Pichia pastoris）密码子偏好性，设计合成了ORTAP40成熟肽目的基因片段，所合成的ORTAP40基因全长120bp，通过基因重组的方法将目的基因克隆到pPIC3.5K表达载体中，成功构建了重组酵母胞内表达载体pPIC3.5K-ORTAP40；其次，用SalⅠ将重组表达质粒pPIC3.5K-ORTAP40线性化后采用电转化法转入毕赤酵母宿主菌GS115，插入到毕赤酵母染色体的高效启动子AOXI的下游，用高浓度的G418抗生素筛选高拷贝转化子，以重组毕赤酵母的菌液为模板，进行PCR鉴定，将阳性重组酵母转化子每24h添加0.5％甲醇进行诱导表达，Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明产物分子量约为4.8KD左右；最后，Trizol法提取酵母总RNA，通过RT-PCR扩增ORTAP40基因，结果显示表达期的酵母细胞中存在ORTAP40 mRNA，进一步表明ORTAP40在酵母中存在表达。表达产物经凝胶过滤色谱处理后进行抑菌试验，结果表明产物对白色念珠菌（ATCC2002）、链球菌（ATCC55121）、大肠杆菌（ATCC25922）具有明显的抑菌作用。随后，利用高效液相色谱技术对重组表达的ORTAP40进行了定性分析，结果表明，ORTAP40在巴斯德毕赤酵母表达系统中成功表达。结果表明，本实验成功扩增了一种绵羊生殖道抗菌肽新基因，并构建了绵羊生殖道抗菌肽胞内表达载体pPIC3.5K-ORTAP40，采用巴斯德毕赤酵母表达系统进行了ORTAP40的单独表达，粗制品具有明显的抑菌活性，并利用高效液相色谱技术判定了目的峰，为进一步研究ORTAP40的抗菌活性、蛋白纯化、产品开发等下游工作奠定了坚实的基础。