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目的:
1.采用急性氧化乐果(Omemoate)中毒大鼠模型,研究法舒地尔(HA1077)对中毒后心肌损害的保护作用及机制。
2.采用氧化乐果染毒的离体培养心肌细胞模型,观察法舒地尔对染毒离体心肌细胞的影响及其可能机制。
方法：
第一部分:法舒地尔对急性氧化乐果中毒大鼠心肌损害的保护作用及机制
1.40只雄性SD大鼠随机分4组(n=10):正常对照组(NC组)、中毒组(PC组)、阿托品治疗组(AT组)、法舒地尔邯可托品治疗组(UN组)。
2.采用腹腔注射氧化乐果(160mg/kg)制作中毒模型。染毒后3min,AT组、UN组给予阿托品(10mg/kg)肌肉注射,之后根据大鼠流涎、瞳孔大小等情况确定阿托品用药次数;其中,UN组在注射阿托品后即刻又给予法舒地尔腹腔注射、继而以q8h维持治疗;对应时间点,AT组和PC组腹腔注射等容积的生理盐水。NC组仅给予等容积的生理盐水腹腔注射。各组实验动物观察48h后脱颈处死或者中毒死亡后立即开胸取出心脏留取标本。
3.采用HE染色、Tunel法,免疫组化染色,观察各组心肌标本的病理学改变、心肌细胞凋亡指数及Bcl-2、Bax蛋白表达水平的变化情况。
第二部分:法舒地尔对氧化乐果染毒大鼠培养心肌细胞的影响及其机制
1.在Langendorff装置上,用胶原蛋白酶逆灌注分离出雄性SD大鼠心肌细胞(CM),DMEM中常规培养。
2.按培养基中氧化乐果剂量,分为低剂晕中毒组(LP)、中剂量中毒组(MP)和高剂量中毒组(HP)。培养12h,根据各组CM的存活率,选取理想的剂量进一步实验。
3.按培养基中法舒地尔剂量,分为低剂量法舒地尔组(LH)、中剂量法舒地尔组(MH)和高剂量法舒地尔组(HH)。培养12h,根据各组CM的存活率,选择最佳法舒地尔剂量进一步实验。
4.根据CM的存活率结果,选择正常对照组(NC)、MP组、MH组进行以下实验。在3h、6h、12h及24h时,测定各组CM的收缩幅度。培养12h,收集各组细胞培养基及细胞蛋白,测定培养基中的LDH含量及心肌细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。
结果:
第一部分:法舒地尔对急性氧化乐果中毒大鼠心肌损害的保护作用及机制
1.各中毒组大鼠生存状况和中毒症状的变化
PC组大鼠于染毒后29±6.3 min全部死亡。在染毒后48 h,UN组9只大鼠存活,1只于第28 h死亡;AT组7只存活,3只死亡(死亡时间,23.3±2.1 h)。与AT组比较,UN组大鼠中毒程度减轻,症状消失时间提前,其中肌力、肌颤差异有统计学意义(P＜0.01)。
2.各组大鼠心肌AI变化
与NC组比较,AT组、UN组心肌AI显著升高(P＜0.01),PC组心肌AI略有升高,但差异无统计学意义;与AT组比较,UN组心肌AI显著降低(P＜0.01)。
3.各组大鼠心肌组织的Bax、Bcl-2蛋白表达的变化
与NC组比较,AT组、UN组心肌组织的Bax蛋白表达增加、Bcl-2蛋白表达减少、Bax/Bcl-2比值升高(P＜0.01),PC组心肌组织的Bcl-2蛋白表达明显减少(P＜0.05),Bax蛋白表达增加、Bax/Bcl-2比值升高,但无统计学意义;与AT组比较,UN组心肌组织的Bax蛋白表达减少,Bcl-2蛋白表达增加,Bax/Bcl-2比值下降(P＜0.01)。
4.各组大鼠心肌组织的病理形态学变化
PC组可见血管充血明显,间质水肿,未见肌纤维紊乱、坏死灶等。AT组可见心肌间质水肿、血管充血、炎症细胞浸润、肌纤维紊乱、局灶性肌纤维断裂、溶解坏死灶等。与AT组比较,UN组病理病变明显减轻,未见坏死灶。NC组心肌组织结构清晰,未见异常。
第二部分:法舒地尔对氧化乐果染毒大鼠培养心肌细胞的影响及其机制
1.中毒组间CM存活率的变化
与NC组比较,各中毒组CM存活率均有显著地降低(P＜0.01):中毒剂量越高,CM存活率越低,差异有统计学意义(P＜0.01)。
2.HA1077组间CM存活率的变化
与MP组比较:LH组和MH组CM存活率明显升高(P＜0.05 or P＜0.01);HH组存活率略下降,但差异无统计学意义。
3.各组CM收缩幅度的变化
与NC组比较,MP组和MH组CM收缩幅度在各个时间点明显减小(P＜0.01)。与MP组比较,MH组CM收缩幅度增大,12h时最为明显(P＜0.01)。
4.各组培养基LDH含量的变化
与NC组比较,MP组和MH组LDH明显升高(P＜0.01)。但与MP组比较,MH组LDH含量降低(P＜0.01)。
5.各组CM中Bax、Bcl-2蛋白的表达
与NC组比较,MP组和MH组心肌细胞Bax蛋白表达增加、Bcl-2蛋白表达减少,Bax/Bcl-2比值升高(P＜0.01);与MP组比较,MH组心肌细胞Bax蛋白表达减少、Bcl-2蛋白表达增加,Bax/Bcl-2比值下降(P＜0.01)
结论:
第一部分:
①法舒地尔对急性氧化乐果中毒大鼠的心肌损害有保护作用,可降低急性氧化乐果中毒大鼠的死亡率。
②抑制Bax蛋白表达、促进Bcl-2蛋白表达,降低Bax/Bcl-2蛋白的比值,进而抑制心肌细胞凋亡是法舒地尔对氧化乐果染毒后心肌损害起保护作用的重要机制之一。
第二部分:
①氧化乐果对CM有明显的损伤作用,促使心肌细胞内LDH的释放,抑制心肌细胞收缩;
②氧化乐果能增加心肌细胞Bax蛋白表达,抑制Bcl-2蛋白表达,提高Bax/Bcl-2蛋白的比值;
③法舒地尔能明显减轻氧化乐果对CM的损害,抑制氧化乐果诱导凋亡调节蛋白Bax、Bcl-2的异常表达。