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疟疾是严重危害人类健康的虫媒传染病,也是世界上除艾滋病以外病例明显上升的传染病,全球每年因罹患疟疾而死亡的人数高达300万。恶性疟原虫对目前所使用的抗疟药产生耐药性对于疟疾流行区来说是一个潜在的巨大灾难,而多靶点抗疟对于避免和延缓抗药性的产生是至关重要的。在当今抗药性疟疾流行的严峻形势下,寻求作用于新靶点的抗疟药势在必行。疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)为疟原虫体内产能所必需的代谢酶,它在疟原虫的整个红内期均表达,是抗疟药作用的理想靶点之一。pLDH能迅速利用氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)类似物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD)作为辅酶参与原虫无氧酵解,从而产生三磷酸腺苷(ATP),为疟原虫的生存提供能量。对于厌氧的疟原虫来说,pLDH是其生长与繁殖所必需的。因此,能够抑制疟原虫乳酸脱氢酶活性的化合物也能够杀死疟原虫,这就为利用pLDH作为新靶点筛选抗疟新药前体提供了可能。为了构建高通量筛选及体外评价代谢酶靶点抑制剂的平台用于抗疟新药开发,本研究采用聚合酶链反应(PCR)扩增恶性疟原虫海南株FCC/HN的LDH基因(PfLDH)并克隆到pTARCET载体中测定全序列,测序结果已由GenBank收录(注册编号DQ825436)。经BLAST检索,本次克隆FCC/HN株的PfLDH基因与K1株PfLDH基因的同源性高达99.79%。为了获得大量可溶性PfLDH,本研究分别利用融合表达载体pGEX-2TK和pET-29a(+)将PfLDH基因导入大肠杆菌BL21和BL21(DE3)菌株中高效表达。结果表明,由pGEX/PfLDH产生的PfLDH融合蛋白主要以包涵体状态存在,而以pET-29a(+)为载体表达PfLDH基因则形成大量可溶性PfLDH,表明后者更适合于PfLDH基因表达。用亲和层析柱纯化的PfLDH重组蛋白包被96孔板,分别加入常山、葛根、砂仁、虎杖等4味中药的粗提物,对其中所含PfLDH活性抑制成分进行体外筛选。结果发现,除常山外,其余3种中药提取物均对PfLDH显示强烈抑制作用。将上述中药粗提物添加到抗疟药微量评价系统中,进一步观察了它们对疟原虫生长的影响。结果表明,除虎杖因技术原因未能检测外,常山和葛根能显著阻遏疟原虫的生长,而砂仁不能抑制疟原虫生长。因此,葛根粗提物既是PfLDH活性抑制剂,又是疟原虫生长阻遏物。对葛根粗提物的进一步有机溶剂萃取及PfLDH活性测定结果表明,水层、正丁醇部位及冰醋酸部位均显示较强抑制作用,乙醇部位抑制作用较弱,而乙酸乙酯部位无明显抑制作用。另一方面,本研究还利用所获得的重组PfLDH作为抗原制备抗PfLDH的多克隆抗体,初步研制出疟疾快速诊断试剂盒,并在培养的虫血上清及疟疾患者血样中检测到PfLDH。本研究构建的抗疟中药筛选及疟疾诊断平台具有较大的应用价值,并具有低价、高效和灵敏等优点,值得进一步研发。