肠外致病性大肠杆菌是一类在特定情况下能引起宿主肠道以外组织感染的病原菌,主要引发肺部感染、泌尿系统感染和脑膜炎等。尽管已经有很多毒力因子被报道参与了上述致病过程,但仍有许多细节未得到清楚的解释。细菌VI型分泌系统已被鉴定存在于包括肠外致病性大肠杆菌在内的多种致病菌中,在细菌致病过程中起到重要作用。本课题利用实验室前期构建的大肠杆菌VI型分泌系统基因缺失株Δhcp1-3和新构建的icmF基因缺失株ΔicmF,研究icmF基因在猪肠外致病性大肠杆菌PCN033中的作用。主要取得以下结果:(1)成功利用正反筛选系统构建了icmF基因敲除突变株,并改进了突变株的筛选方法。(2)表型实验结果显示,T6SS相关基因缺失并不影响细菌的生长、运动和抗药能力,但能显著增强细菌形成生物被膜的能力。(3)细胞实验结果显示,T6SS功能的缺失导致细菌粘附、侵入上皮细胞能力增强。另外,T6SS功能的缺失并不影响细菌对巨噬细胞的毒性,但极显著的降低了细菌抵抗巨噬细胞吞噬和在巨噬细胞内存活的能力。在所有的表型检测中,ΔicmF和Δhcp1-3的表现基本相同,可以初步认为icmF基因功能与T6SS紧密相关。为了进一步了解致脑膜炎大肠杆菌的致病机制,本研究进一步构建了脑膜炎模式菌株RS218的Tn5转座子突变体库。以人脑微血管内皮细胞为模型,筛选侵入能力缺陷的突变株。通过对764株突变株的筛选,初步获得33株侵入能力明显下降的突变株。进一步通过检测候选突变株的生长速率,筛选掉2株生长速率下降的突变株。经细胞侵入实验的复检,最终获得31株突变株对HBMEC的侵入率。采用TAIL-PCR技术,获得了Tn5插入位置一侧的基因组序列,经测序和序列分析,定位到29个基因内部插入和两个基因间插入。其中有一个突变发生在已报道参与细菌突破血脑屏障的fimH基因内。本研究的筛选结果为后续大肠杆菌致脑膜炎的机制研究奠定了基础。