氟(fluorine)是一种以多种形态广泛分布于自然界中的元素,它通常是与其他元素结合形成共价化合物,很少以自由离子态分布。在自然界中的水域中,氟的含量通常很低,一般不超过1mg/L。但是由于人为的活动,如合成磷肥、合成色素、半导体和玻璃等工业产品的制造与应用,导致氟的含量的急剧上升。虽然氟被认为是人和动物健康的一种重要的必要元素,但是高浓度的氟能够对多种组织和器官造成损伤,尤其是骨骼,将可能造成氟骨症(skeletal fluorosis)。骨对于脊椎动物身体的支持、运动、器官保护和矿物质的储存具有至关重要的作用。骨的形成方式有两种:膜内成骨和软骨内骨化。绝大多数的骨是通过软骨内骨化这一方式而形成。软骨内骨化包括三个步骤,分别为软骨细胞的增殖、软骨细胞的肥大和软骨基质的成熟。这个复杂的生物学过程是由一系列分子和胞外成分共同调控。一般认为系统因子,-转录因子以及旁分泌因子共同参与到软骨内骨化的调控中。其中系统因子包括,生长激素(GH)和甲状腺激素(THs);转录因子中有性别决定基因9(Sox9);旁分泌因子包括纤维生长因子(FGFs),骨形态发生蛋白(BMPs),印度豪猪蛋白(Ihh),甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)和胰岛素样生长因子(IGFs)。一直以来,甲状腺激素被认为是骨骼生长过程中一个重要调节因子。在甲状腺功能低下的儿童中,其长骨生长缓慢,骨的成熟被抑制。甲状腺激素的功能发挥主要是通过其受体α(TRα)介导。在软骨中甲状腺受体α的表达量远高于受体β(TRβ)。作为旁分泌因子,印度豪猪蛋白(Ihh)主要表达于肥大前软骨细胞中,主要参与早期软骨内骨化软骨中一细胞增殖时期。而Sox9主要表达于软骨细胞增殖区,肥大前软骨细胞以及肥大软骨细胞区域。表明其功能是贯穿整个软骨内骨化过程中。目前,骨骼发育中软骨内骨化的相关分子机制的研究主要集中于哺乳动物,对于两栖类骨骼发育中软骨内骨化相关分子机制研究还是很少。因此,研究两栖类骨骼发育中软骨内骨化相关分子机制,以及氟对于两栖类软骨内骨化的影响具有十分重要的理论意义。两栖动物的肢体在胚后发生,其幼体发育环境的水生具有一定可控性的特点。因此,可通过改变不同浓度的离子水暴露处理,探讨氟对软骨内骨化的影响,对于两栖动物生存环境的保护和治理具有一定的应用价值。本研究以中华大蟾蜍幼体为对象,探讨软骨内骨化相关分子机制,以及氟对两栖类软骨内骨化的干扰机制。本研究内容包括两部分,首先,我们运用骨骼双染色方法观测中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)幼体后肢从Gs40到Gs46期的形态发生变化。对幼体不同发育时期后肢进行转录组测序,并分析与软骨内骨化相关基因在Gs40,Gs42和Gs46期的表达谱。接着对转录测序结果进行RT-qPCR验证。最后用原位杂交技术在生长软骨中定位Sox9和Ihh基因表达位置。第二部分,我们将Gs3-Gs46期蝌蚪分别暴露于0、1、5、10和20 mg F-/L的氟离子水中。检测不同浓度氟处理后蝌蚪肢在G40到G46的发育变化。用对照和10 mg F-/L组Gs40,Gs42和Gs46期蝌蚪后肢进行转录组测序,分析软骨内骨化相关基因的差异表达谱,RT-qPCR验证。原位杂交定位Sox9和Ihh在生长软骨中的表达。实验的主要结果和结论如下:1、骨骼双染色显示,在中华大蟾蜍变态过程中其后肢骨化逐渐增强以及后肢的骨化次序是由近端到远端。例如,股骨、胫腓骨和跖骨在Gs40期开始骨化,并在G42期骨化完全。此外整个后肢骨骼系统在Gs46期骨化完全。表明中华大蟾蜍后肢的软骨内骨化是在蝌蚪变态过程进行,后肢可作为研究软骨内骨化的动物模型。2、转录组测序结果显示,在后肢cDNA文库中总共有31个与软骨内骨化相关的基因,并分析了在变态过程中他们的表达图谱。同时Sox9,Ihh,FGF3,Wnt1Ob,D2,D3,TRα,TRβ基因进行RT-qPCR验证,结果与转录组数据基本一致。证明本实验的转录组数据是可靠的。3、原位杂交定位显示,Sox9mRNA主要表达于后肢的软骨细胞增殖区,肥大前软骨细胞以及肥大软骨细胞区域;而Ihh主要表达于肥大前软骨细胞区域。表明Sox9的功能贯穿整个软骨内骨化过程,而Ihh的功能主要在细胞增殖时期。4、氟暴露后的骨骼双染色显示,10 mg F-/L能够抑制蟾蜍幼体后肢的软骨内骨化。在G40期,对照组蟾蜍幼体后肢的腓附骨和胫骨已经开始骨化,而100 mg F/L处理组的腓附骨和胫骨的骨化还未开始。这表明氟暴露将抑制幼体后肢软骨内骨化。5、转录测序结果显示,10mgF-/L处理下调了Ihh,Sox9,D2,D3,TRα,TRβ,Wnt10b,FGF3和BMP6在蟾蜍幼体后肢的mRNA表达,但是上调了ObRb和HHAT mRNA表达。这些基因的RT-qPCR表达变化与转录测序结果基本一致。表明氟能够影响软骨内骨化相关的基因,从而会抑制后肢的软骨内骨化。6、原位杂交结果显示,10 mg F-/L的暴露并未改变Sox9和Ihh在蟾蜍幼体后肢生长软骨中的表达位置。这表明氟没有改变软骨内骨化相关基因的表达位置。综上所述,软骨内骨化这一复杂的生物学过程需要一系列分子相互作用,共同调控。其中系统因子,转录因子以及旁分泌因子参与了软骨内骨化的三个阶段的调控。此外,通过氟暴露产生蟾蜍幼体后肢的软骨内骨化过程被抑制以及软骨内骨化相关基因的表达同时被抑制的结果分析,氟可能是通过抑制相关基因的表达而影响软骨内骨化的。本研究结果将有助于我们进一步理解两栖类变态过程中软骨内骨化分子机制,并为未来研究软骨内骨化提供一个非常有价值的基因背景。另一方面,本研究也为我们理解环境氟污染对两栖类软骨内骨化的影响提供一个新的视角。