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第一部分重组人肿瘤坏死因子β原核表达载体的构建、表达及活性测定目的构建肿瘤坏死因子8的原核表达载体,并进行TNFβ的诱导表达,为后续TNFβ的功能及其与小分子抑制剂相互作用的研究奠定基础。方法通过构建PAYZ-STII-hTNFβ-6his, pET44-hTNFβ-6his两种不同的原核表达载体,并分别转化16C9和BL21(DE3)感受态细胞,经不同方法诱导表达目的蛋白并比较两种载体中hTNFβ表达量大小的差异,选出蛋白表达量最大的载体和菌株组合,并利用SDS-PAGE和Westernb Blot技术检测并鉴定,比较可溶蛋白和包涵体蛋白比例。利用高浓度尿素(8M)溶解包涵体,并利用稀释复性技术得到具有生物学活性的hTNFβ,纯化后的hTNFβ蛋白在小鼠成纤维细胞系L929上测试其杀伤活性。结果SDS-PAGE和Western Blot结果显示表达产物可溶性蛋白比例较低,大部分以包涵体形式存在,透析复性逐级降低尿素的过程中出现蛋白沉淀现象,改换稀释复性方法复性后,蛋白复性液在L929细胞系上做活性测试,复性后的蛋白溶液可以引起L929细胞的凋亡,具有一定的生物学活性。结论成功构建PAYZ-STII-hTNFβ-6his, pET44-EK/LIC-hTNF-6his两种原核表达载体,并利用包涵体变性和复性技术得到了具有生物学活性的肿瘤坏死因子β蛋白。第二部分靶向肿瘤坏死因子β小分子抑制剂的筛选及其功能鉴定目的通过计算机虚拟筛选和细胞活性筛选,获得能靶向抑制肿瘤坏死因子β(TNFβ)的细胞毒活性的小分子抑制剂。方法根据TNFβ与肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(TNFR1)结合的复合晶体结构,采用计算机虚拟筛选方法初步选择对接结果较好的105个小分子化合物(C1-C105),并对其进行细胞活性筛选；MTT法检测小分子化合物抑制TNFβ对L929细胞的细胞毒性；流式细胞术测定小分子化合物对TNFβ引起的细胞凋亡的抑制作用；采用碘化丙啶(PI)单染和流式分析技术检测小分子化合物对L929细胞周期的影响；采用Western Blot和双转盘激光共聚焦显微镜分析小分子化合物对TNFβ引起的下游Caspase3活化的抑制作用。结果C35能有效抑制TNFβ引起细胞毒作用,且这种抑制作用呈现剂量依赖性(半数抑制浓度=8.19μmol/L);C35具有较低的细胞毒性,且对L929细胞周期无影响；C35能阻断TNF β与其受体结合后引起的细胞凋亡通路,显著抑制TNFβ引起的L929细胞凋亡。结论成功筛选到一个TNFβ小分子抑制剂C35,其能阻断TNFβ引起的细胞凋亡通路,高效抑制’TNFβ的细胞毒活性。