黄化与去黄化过程中拟南芥幼苗环化RNA表达与功能研究

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环状RNA(circular RNA,circRNA)是由线性RNA的3’和5’末端连接起来形成的,区别于传统的线性RNA,是一种特殊的内源性RNA分子,因其结构不容易被RNA酶降解,因此比线性RNA更稳定。circRNAs可在生物体中以多种类型大量存在,具有调控基因表达的作用,其广泛性、保守性及组织特异性等性质都预示着它在未来可能成为一种新型的生物标志物。目前,已经在动物中鉴定了大量具有调节能力的非编码circRNAs,但在植物中的研究却很少。光是植物生长发育的最重要的环境因素之一,影响植物幼苗的形态建成、叶绿体的建成和光合作用等过程。本研究选取模式植物拟南芥为实验材料,通过高通量测序,生物信息学分析,并结合分子生物学的方法,对黄化与脱黄化拟南芥幼苗建成过程中circRNAs的表达情况进行深入研究。主要结果如下:(1)通过RNase R消化、高通量测序与生物信息学分析,共鉴定得到499个circRNAs分子,随机分布在拟南芥的1-5号染色体、线粒体基因和叶绿体基因组中。173个circRNAs来源于编码蛋白质的基因的外显子区域,27个来自于内含子区域,309个circRNAs来自于基因间区。共检测到485个是差异表达基因,与黄化拟南芥幼苗相比,脱黄化样本中有369个显著上调和116个显著下调的circRNAs。(2)GO和KEGG分析并注释circRNAs亲本基因的生物学功能,发现GO数据库中注释到与细胞代谢、刺激反应、质体/叶绿体组分、催化活性和蛋白质结合等重要功能;KEGG数据库中注释到与光合作用和碳代谢相关的重要代谢通路,表明circRNAs可能参与了光调控的拟南芥脱黄化过程中。此外,发现33个circRNAs具有miRNA的结合位点,并且circRNAs与miRNA结合方式多种多样,表明在拟南芥中一些circRNAs是潜在的miRNA靶标。因此,植物circRNAs可能通过与miRNA相互作用在基因表达调控中发挥作用。(3)高通量测序鉴定出10个circRNAs从叶绿体基因组中形成,分布有外显子、内含子和基因间区;其中有6个circRNAs来自蛋白质编码基因,分布在叶绿体基因组的LSC和SSC区;只有athcirc477和athcirc481的反向剪接位点是传统的剪接位点,具有GT/AG信号。(4)使用数字PCR优化低丰度circRNAs的检测方法,在叶绿体中共鉴定出四个cp-circRNAs,分别是ath circ 476,ath circ477,athcirc478和athcirc480。与RNA-seq结果相似,ath circ476在黄化拟南芥幼苗中的表达量上调,ath circ 477,athcirc478和athcirc480在脱黄化拟南芥幼苗中的表达量上调。检测ath circ 476的亲本基因ycf5的表达,发现在从幼苗的暗形态建成到光形态的过程中,ycf5和ath circ 476显著下调。差异表达的亲本基因与相应的circRNA具有共同的表达趋势,表明在黄化幼苗中二者存在共表达的模式。(5)有5个circRNAs参与了光合作用,由Rubisco小亚基的RBCS-1B、RBCS-2B和RBCS-3B编码基因构成。通过线状扩增引物和环状扩增引物引物和sanger测序,验证出由RBCS-2B的exon4与exon5,和RBCS-3B的exon3构成的反义环状RNA,即circRBCS。发现circRBCS在根中没有表达,在可进行光合作用的组织中均有表达,在叶中表达量最高,与亲本基因RBCS的组织表达相似。黑暗下生长三天的拟南芥幼苗,随着光照时间的延长,circRBCS和亲本基因RBCS的表达量逐渐增加,并且表达趋势一致,猜测circRBCS可能与亲本基因有共表达,可能在转录水平上调节亲本基因。(6)构建拟南芥circRBCS过表达株系,获得了阳性株系4株,发现circRBCS的表达量增加并未导致RBCS表达的增加;表型分析发现,未发现明显的表型变化。可能由于过表达载体的构建不适合植物体。综上所述,本研究以拟南芥col为材料,通过高通量测序、生物信息学分析和分子生物学手段,对幼苗建成过程中的circRNAs表达分析进行研究,揭示了拟南芥叶绿体中存在稳定表达的circRNAs,并且光合作用过程有circRNAs的参与,可能参与亲本基因的表达调控,为进一步揭示circRNAs在植物中的功能提供了理论依据。
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