共济失调,是一种神经性疾病,其特征是失去平衡和运动协调能力并经常伴随着神经障碍例如步态不稳、测距不准、协同不能以及眼球震颤等。共济失调的患者初期表现出来的是笨拙的和不能平稳的行走,以及说话含糊不清等特征。最终病人会丧失协调的吞咽和呼吸能力,这将会是致命的。许多形式的共济失调能追溯到小脑的缺陷,因为小脑在运动协调和运动精确调控中起到重要的作用。小脑突触可塑性的主要产生位点是平行纤维(parallel fiber,PF)—浦肯野细胞(Purkinje cell,PC)突触的长时程抑制(long-term depression,LTD),和它相对应的,长时程增强(long-term potentiation,LTP)。小脑突触可塑性的缺陷,比如各种基因敲除或转基因鼠中,都表现出小脑运动协调和运动学习等功能的损害。G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor,GPCR)是一种与三聚体G蛋白偶联的细胞表面受体。是迄今发现的最大的受体超家族,且分布广泛,具有重要的生理功能。Lgr4属于GPCR中富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体家族成员,具有高度的保守性。在人类中几乎分布于大部分的组织和器官。利用基因敲除小鼠模型,LGR4基因的许多生物学功能陆续被报道出来。之前的研究已经表明丢失LGR4基因会导致在许多方面的发育缺陷,包括子宫内生长阻滞以及胚胎期和出生后的致死,骨的形成以及重建的功能异常,雄性生殖系统发育缺陷,眼前节发育不良,肾脏发育异常,头发基板形成受损,以及胆囊和胆囊导管发育的缺陷等。最近还发现LGR4基因对小肠中的潘氏细胞的分化和维持小肠干细胞的干细胞特性有着重要作用。但迄今为止还没有任何相关报道显示LGR4基因在神经系统中的作用。本实验利用LGR4基因敲除小鼠模型,对LGR4基因在平衡和运动协调,以及小脑中的功能进行了一系列的研究。共分为以下三个部分:1.Lgr4基因敲除鼠具有小脑共济失调表型我们对Lgr4基因敲除小鼠进行了一系列的动物行为学分析。首先通过足迹分析实验,我们发现Lgr4基因敲除鼠在步态宽度、交替系数以及线性运动等各项指标方面和同窝的野生型小鼠有着显著性差异。接着在与平衡和运动协调及运动学习有关的测试中,发现Lgr4基因敲除鼠无论是在转棒实验还是平衡木实验测试中,与野生型小鼠相比有显著性差异。另外,我们发现Lgr4基因敲除鼠有着正常的其他行为能力,例如基本运动能力和抓握能力。2.Lgr4基因敲除鼠的小脑浦肯野细胞减少通过β-半乳糖苷酶组织化学染色发现,Lgr4基因是在小鼠的浦肯野细胞中高表达。另外通过免疫组织化学和免疫荧光化学染色,观察了不同年龄阶段(4周、8周和28周)的野生型和Lgr4基因敲除型鼠的浦肯野细胞的数目,以及浦肯野细胞的形态。发现成年的Lgr4基因敲除鼠在各个年龄阶段均有明显的浦肯野细胞的减少(约20%-30%),且未发现存活的浦肯野细胞的形态与野生型的存在明显差异。随后检测了从出生后第1天到第10天时间内,两种基因型的小脑发育情况以及浦肯野细胞数目的对比。发现出生后的发育过程中从小脑叶片的发育到小叶皮层各细胞层的发育都无显著性差异。且β-半乳糖苷酶组织化学染色显示,Lgr4基因从出生后第1天开始就在小脑的浦肯野细胞中有表达。从出生后第5天开始,Lgr4基因敲除鼠的小脑浦肯野细胞的数目明显的少于野生型鼠,且这种数目差异一直持续到第10天。3.Lgr4基因敲除鼠小脑浦肯野细胞的突触可塑性受损通过离体脑片的场电位记录发现,Lgr4基因敲除型鼠的小脑PF-PC的刺激强度-反应曲线无明显改变,但双脉冲易化反应(PPF)与野生型相比有明显减小。同时发现CF-PC的基本突触传递无明显变化。接下来我们发现Lgr4基因敲除鼠能诱导出的LTD和LTP,但与野生型鼠相比有着明显的降低。由于各种长时程的神经的可塑性都依赖于活性驱动的基因表达。通过免疫组织化学和免疫荧光化学染色发现,Lgr4基因敲除鼠中只有极少数的浦肯野细胞能发现有磷酸化的CREB的表达,而在野生型鼠中磷酸化的CREB的表达于几乎所有的浦肯野细胞中。且未发现β-catenin和ERK1/2在两种基因型鼠的小脑中表达有任何差别。加入cAMP的激活剂forskolin之后,可以明显发现Lgr4基因敲除鼠的浦肯野细胞中能发现有大量的磷酸化的CREB的表达。随后,利用离体脑片场电位记录技术,也发现加入cAMP的激活剂forskolin之后Lgr4基因敲除鼠受损的PF-PC突触的LTD和LTP都与野生型鼠的类似。综上所述,本论文第一次发现了 Lgr4基因在小脑浦肯野细胞的发育和小脑的突触可塑性,以及运动协调和运动学习中的重要作用。通过动物行为学方法首次发现了 Lgr4基因敲除小鼠表现出严重的小脑共济失调表型。接着通过免疫组化染色发现Lgr4基因特异性的表达在小脑的浦肯野细胞中,并发现敲除鼠的小脑有20-30%左右的浦肯野细胞的减少。电生理的方法揭示基因敲除鼠中小脑的平行纤维-浦肯野细胞突触的LTD和LTP受损。加入cAMP的激活剂forskolin可以重新敲除鼠中失活的CREB并恢复受损的突触可塑性。由此推断Lgr4基因可能通过cAMP-PKA-CREB信号通路影响CREB的活化来参与小脑的突触可塑性,进而影响小脑的平衡和运动学习能力。