研究背景及目的:mRNA翻译调控机制一直是细胞生物学领域的一个重要科学问题和研究热点,这不仅因为它有助于我们掌握细胞生物学行为及功能的发生机制,而且有助于我们了解个体发育以及众多疾病发生、发展的分子机制,为探索疾病的防治提供新的理论和药物筛选靶点。真核细胞mRNA在细胞核中转录、剪切后输出到细胞质中翻译形成细胞蛋白,在细胞质中多种信号通路的调节下进行翻译后修饰,从而发挥蛋白质的生物学功能。机制性雷帕霉素靶分子(mechanistic target of rapamycin,mTOR)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,mTOR以mTORC1和mTORC2两种复合物形式存在,参与细胞代谢、增殖迁移和自噬凋亡等过程。研究表明mTORC1通过磷酸化其下游底物4E-BP促进mRNA的翻译,而由mi RNA与靶mRNA、Ago蛋白、GW182蛋白等结合形成的mi RNA介导的静默复合体(RISC)是负性调控mRNA翻译的重要机制。那么,细胞作为一个整体是如何协调这两种相反的mRNA翻译调控机制的呢?mTORC1是否以及如何调控RISC-mi RNAs功能的呢?既往研究主要集中于mTORC1信号通路对单个mi RNA的研究,对于mTORC1对mi RNA及RISC复合物的调控却鲜有报道。因此,本研究对mTORC1调控mi RNA介导的基因静默功能作出初步研究。研究方法:1、用Co-IP和体外Pulldown实验验证mTORC1与Ago2蛋白是否有结合,并用分子克隆技术构建Ago2不同结构域片段探究其结合具体机制;2、用Co-IP和体外激酶实验探究mTORC1不同活性下Ago2 387丝氨酸位点磷酸化水平变化;3、用RIP实验、捆绑实验和Co-IP实验检测Ago2 387丝氨酸位点磷酸化后其结合RNA、GW182能力变化。研究结果:1、体内、体外实验同时验证了mTORC1与Ago2蛋白有结合,并且发现mTORC1中Raptor分子与Ago2蛋白的PAZ结构域直接结合;2、Ago2 387丝氨酸位点磷酸化水平随mTORC1活性变化而变化。当mTORC1激活后,Ago2 387丝氨酸位点磷酸化水平明显增高,反之亦然。而当Ago2 387位点突变后则不能被mTORC1磷酸化;3、Ago2 387丝氨酸位点磷酸化后Ago2蛋白结合RNA、GW182蛋白的能力明显降低。研究结论:mTORC1通过直接磷酸化Ago2 387丝氨酸位点调控其结合RNA、GW182蛋白能力,进而影响mi RNA介导的RISC复合体的形成及静默效应的发挥。mTORC1激活后,Ago2 387丝氨酸位点磷酸化水平增强,Ago2结合RNA和GW182蛋白能力减弱,抑制了mi RNA介导的基因静默。