论文部分内容阅读
背景和目的:肝纤维化是由于肝脏受到病毒感染、酒精刺激、药物和化学毒物等长期作用而缓慢形成,此过程涉及多种细胞和细胞因子介导的炎症及损伤修复。肝纤维化发展到后期会形成以假小叶形成、肝功能减退为标志的肝硬化。肝硬化是临床上常见的难治性疾病。肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells,HSC)在体内存在静止型与活化型两种状态。静止型的HSC位于肝板与血管内皮细胞的Disse间隙内。在肝脏受损时,静止型HSC活化为肌成纤维细胞,并在受损区域聚集,从而分泌大量细胞外基质,最终形成肝纤维化。因此,HSC的活化是肝纤维化的中心环节。研究报导指出,磷酸鞘胺醇(Sphingosine1-Phosphate,S1P)及其受体(S1PRs)信号轴参与多种病理过程,如炎症反应、肿瘤发生以及血管生成等。本实验室前期研究结果证实,S1P可以促进小鼠骨髓间充质干细胞迁移至受损肝脏,并分化成肌成纤维细胞,从而参与肝纤维化发生；S1P/S1PR3信号通路在胆汁淤积性肝损伤中也起重要调节作用。但S1P是否参与HSC的活化尚未见报道。本研究拟探讨S1P对肝星状细胞活化的作用机制,从而为肝纤维化的治疗提供新的作用靶点。
方法:
1.用定量PCR、蛋白免疫印迹(Western blotting)、羟脯氨酸测定试剂盒等方法检测α-平滑肌肌动蛋白(Smooth Muscle Actin-α,α-SMA)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原等mRNA、蛋白表达水平,从而判定肝星状细胞的激活情况。
2.用胆管结扎(Bile Duct Ligation,BDL)和CCl4腹腔注射的方法,造不同病因的小鼠肝损伤(肝纤维化)模型；用定量PCR的方法检测动物肝组织中α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原等mRNA的表达水平；用测定肝组织羟脯氨酸含量的方法评估胶原的含量;用天狼猩红染色的方法及图像分析软件测定肝组织纤维化的程度。
结果:
1.经HSC的标志物α-SMA和Desmin免疫荧光染色,证实我们分离培养出纯度较高的原代小鼠HGC;
2.用RT—PCR和免疫荧光方法证明原代小鼠的HSC表达S1P受体1-3；
3.S1P显著上调原代小鼠HSC中α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达,且羟脯氨酸含量也相应增加；
4.用受体拮抗剂或RNA干扰技术,证明S1PR1和S1PR3促进原代小鼠HSC的活化,而S1PR2作用不明显;
5.整体实验证明,S1PR3的拮抗剂Suramin减少小鼠肝组织中α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的mRNA的表达,降低肝组织羟脯氨酸含量,且呈剂量依赖性；
6.人的肝星状细胞系LX-2同样表达S1PR1-3,且S1P通过S1PR1和S1PR3促进其活化,而S1PR2作用不明显。
结论:
本研究在细胞和整体水平证实S1P通过其受体S1PR1、S1PR3途径促进小鼠和人HSC的活化,从而可以此为靶点阻止肝损伤时HSC的活化,治疗肝纤维化。