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肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是人类最常见的恶性肿瘤之一。尽管在肝癌的治疗中取得了很大进步，肝癌仍是癌症相关死亡的第三大原因，患者的5年生存率不到5％。调查肝癌发生发展的分子机制，对于开发新的诊断、治疗和预后方法具有重要意义。MicroRNA（miRNA）是一类丰富的非编码的短RNA，在转录后水平通过诱导mRNA的降解或抑制其翻译从而抑制靶基因的表达。最近，越来越多的报告表明，异常表达的miRNA与各种人类癌症，包括肝癌有关，miRNA可以作为肿瘤抑制基因或癌基因参与人类癌症的发生发展。这对肝癌的诊断和治疗应用提供了新的途径。最近的miRNA表达谱研究已经证明了miR-124在肝癌表达下调，然而，其在肝癌发生过程中的潜在的功能及相关机制仍未明确。本实验从肝癌组织标本和细胞系中检测miR-124的表达，然后构建miR-124过表达慢病毒载体在体内外研究其对肝癌生长的抑制作用，并进一步探讨其机制。研究方法本课题首先应用实时定量RT-PCR方法检测18对配对的肝癌组织和癌旁组织以及肝癌细胞株和正常肝细胞系LO2中成熟miR-214的表达情况。然后构建miR-214的慢病毒载体，包装慢病毒，并感染HepG2细胞，筛选慢病毒稳定株。检测稳定过表达miR-214对肝癌细胞的生长、增殖、克隆形成能力以及细胞周期的影响；并进行裸鼠成瘤实验，观察miR-214对HepG2细胞成瘤能力的影响。应用生物信息学软件预测miR-214可能作用的靶基因，并采用荧光素酶报告实验、实时定量RT-PCR、Western blot进行靶基因验证。通过β-catenin RNA干扰和恢复表达实验，检测对细胞增殖的影响。检测miR-214对β-catenin通路下游蛋白CyclinD1、c-Myc、TCF-1和LEF-1的表达水平的影响。研究结果1.miR-214在肝癌组织和肝癌细胞系Hep3B，SK-HEP1，SMMC-7721，Huh7，HepG2细胞中的表达显著下调。2.建立了表达miR-214的HepG2细胞稳定株。3.细胞生长曲线表明miR-214HepG2细胞生长缓慢；MTT实验表明miR-214过表达可抑制HepG2细胞的增殖；miR-214稳定株的HepG2细胞集落生长能力降低；细胞周期检测发现miR-214组HepG2细胞在G1/G0比例为69.28%，高于对照组的54.62%；miR-214组HepG2细胞S期细胞的比例为19.56%，明显较对照组比例33.48%低，结果提示miR-214可通过引起细胞G1期阻滞抑制肝癌细胞增殖。4.用miR-214稳定株HepG2细胞和对照慢病毒细胞，建立裸鼠肝癌移植瘤模型，结果发现，miR-214组肿瘤生长明显慢于对照组；皮下接种BALB/c裸鼠25d后，miR-214组肿瘤体积为对照组的32%，重量为对照组的37.5%。5.TargetScan等软件预测CTNNB1可能是miR-214作用的靶基因。荧光素酶报告实验结果表明，转染miR-214表达质粒能够抑制共转染的CTNNB1-3’-UTR载体荧光素酶基因活性，而共转染miR-214表达质粒和CTNNB1-3’-UTR靶位点突变载体，荧光素酶活性未见明显改变。Western blot检测发现miR-214可抑制β-catenin蛋白的表达；实时定量RT-PCR结果显示转染miR-214表达质粒后，β-catenin mRNA的表达量和对照组相比无显著差异。6.转染shβ-catenin干扰质粒可降低β-catenin表达，抑制HepG2细胞增殖。对稳定表达miR-214的肝癌细胞，转染不含3’-UTR的β-catenin过表达质粒，可恢复β-catenin蛋白表达，逆转miR-214对HepG2细胞增殖的抑制作用。7.Western blot结果显示miR-214稳定表达株中CyclinD1、c-Myc和TCF-1的表达水平下降，miR-214稳定表达株裸鼠移植肿瘤组织中CyclinD1、c-Myc和LEF-1的表达水平比对照组下降。研究结论1.miR-214在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达显著下调。2. miR-214可以在体外和在体内抑制肝癌细胞的生长。3.CTNNB1是miR-214的靶基因。miR-214可以通过抑制β-catenin通路影响肝癌生长。