蛋白酶抑制剂（proteinase inhibitor，PI)是对蛋白水解酶有抑制活性的一种小分子蛋白质，在动物、植物、微生物等中普遍存在。PI能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合，形成稳定的复合体，抑制酶的催化活性或阻止酶原转化为有活性的酶，从而抑制了蛋白酶降解蛋白质的能力，并在生物体内与各种调控作用的蛋白酶形成一定的动态平衡，调节生物体内许多重要的生命过程。蛋白酶抑制剂在植物对害虫，病原体的侵染防御系统，及调节蛋白酶活性和蛋白质代谢等方面有着十分重要的作用及具有广泛的应用前景。 本论文以龙葵丝氨酸型蛋白酶抑制剂Ⅱa（Solanum americanum proteinase inhibitorⅡa，SaPIN2a)，龙葵丝氨酸型蛋白酶抑制剂Ⅱb（Solanum americanum proteinase inhibitorⅡb，SaPIN2b)和水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatin from jelly fish Cystatin J)三种蛋白酶抑制剂为研究对象，通过植物基因工程的方法，研究了其在植物抗虫、抗病毒、抗菌、保护外源蛋白等方面的功能及在农业生物防治和植物细胞生物反应器中的应用，并取得以下结果： 1.本研究利用农杆菌侵染法转化烟草，获得超量表达SaPIN2a转基因烟草，通过对SaPIN2a及SaPIN2b转基因烟草做PCR，Northern blot及Western Blot检测，证明了这两种基因分别在转基因烟草中超量表达。酶抑制活性检测发现这两种蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶有较高的抑制作用，并且对棉铃虫和斜纹夜蛾的中肠类胰蛋白酶也有抑制作用。有趣的是，利用扫描电镜还研究发现超量表达SaPIN2a转基因植株叶片上的毛状体比对照组明显增多，而气孔的数量没有增加，这表明蛋白酶抑制剂可能参与调控毛状体的发育，同时增加的毛状体也可以增强转基因植株叶片对外来虫害的抵御能力。通过抗虫实验，我们发现转基因植株对棉铃虫和斜纹夜蛾的生长发育有抑制作用，提高了抗虫能力，因此这两种蛋白酶抑制剂基因可以用于抗虫植物基因工程的研究以及棉铃虫，斜纹夜蛾等鳞翅目昆虫的生物防治。 2.本研究利用预测具有分泌功能的SaPIN2a信号肽和SaPIN2a cDNA构建含潮霉素筛选基因的植物表达载体35S—2aSP—SaPIN2a，利用农杆菌侵染法转化烟草BY—2细胞，PCR鉴定到阳性转化株系，RT—PCR表明转基因株系中SaPIN2a基因的转录表达，western blot同样检测SaPIN2a在细胞培养基中的存在。意外的是，我们检测到BY—2细胞中可能存在与SaPIN2a同源性较高的蛋白的存在，并且有很强的表达。培养基蛋白酶活性检测发现转基因BY—2细胞培养基中蛋白酶活性比对照株系要低，可能是分泌的SaPIN2a蛋白抑制了部分培养基中丝氨酸型蛋白酶的活性，因此可以在植物细胞生物反应器中利用该表达系统来保护外源重组蛋白。本研究还从健康人血液中提取总RNA，利用RT—PCR法克隆全长的HSA cDNA序列，构建超量表达载体35S—HSA，同时构建含有分泌功能的信号肽及HSA cDNA的植物表达载体35S—SPp—HSA。以购买的HSA蛋白作为抗原，免疫新西兰兔，制作HSA多克隆抗体，以便后面的检测之用。研究用农杆菌介导法将35S—HSA的表达菌株转化烟草，BY—2和胡萝卜悬浮细胞，经含卡那霉素（Kan)的培养基筛选，获得卡那抗性烟草，BY—2悬浮细胞和胡萝卜细胞；同时将35S—SPp—HSA的表达菌株转化BY—2细胞。CTAB法提取转基因植物悬浮细胞基因组DNA做PCR检测，结果发现HSA cDNA在转化的细胞基因组中整合。RT—PCR也表明转基因株系中HSA基因的转录表达，对PCR鉴定阳性的细胞扩大培养，提取转基因细胞总蛋白做western blot检测证明35S—HSA的表达载体转化株系检测到微弱HSA蛋白的表达，并且有降解片段。而含有信号肽及HSA cDNA的表达载体转化株系检测到HSA蛋白的表达，但是表达量不高。进一步研究我们将蛋白酶抑制剂SaPIN2a和HSA通过共转化转在BY—2细胞培养基中共表达，利用蛋白酶抑制剂降低培养基中蛋白酶的活性，保护重组蛋白的表达，减少其在培养基中的降解，以期提高药用蛋白HSA的表达量。目前的结果来看，共转化蛋白酶抑制剂的转基因细胞株系培养基中外源蛋白HSA表达量并没有明显提高，这可能与HSA的自身表达低有关，我们需要做进一步的研究。 3.本研究利用农杆菌侵染法分别将含有35S启动子及水稻RSs1启动子驱动雪花莲凝集素表达的载体转化烟草，获得的转基因植株，并与本实验室已有的含韧皮部特异表达的SaPIN2a启动子驱动GNA表达的转基因烟草比较各个转基因株系的GNA蛋白表达。研究结果表明GNA基因已经整合到植物细胞基因组中，RT—PCR显示转基因株系中GNA基因的转录表达，但是western blot仅检测到GNA在35S启动子驱动下的表达，而其他两个启动子驱动的表达载体转化的植株并未检测到GNA的存在。这表明SaPIN2a启动子和水稻RSs1启动子在烟草植株中的表达活性比较弱或不能成功地驱动GNA表达。 4.本研究通过在大肠杆菌中诱导表达水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin J，并利用Talon金属离子亲和层析柱纯化获得Cystatin J高纯度融合蛋白，活性测定表明Cystatin J具有对木瓜蛋白酶有抑制作用。研究将纯化的Cystain J融合蛋白作为抗原，免疫新西兰兔，获得Cystatin J多克隆抗体。同时将纯化的Cystain J融合蛋白用来做抗真菌实验，结果表明Cystain J融合蛋白对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani)有抑制作用，而对尖孢镰刀菌（Fusariumo xysporum)，炭疽菌（Anthrax)，哈茨木霉（Trichoerma harzianum)等都没有抑制效果。进一步通过在转基因烟草中超量表达Cystatin J的研究，发现Cystatin J成功的整合到烟草基因组中，利用自制的Cystatin J多克隆抗体做Westen blot也检测到Cystatin J蛋白在转基因烟草叶片中的表达。提取转基因植株叶片总蛋白，活性检测表明转基因烟草叶片可溶性总蛋白对木瓜蛋白酶同样具有抑制作用，并且对立枯丝核菌有抑制效果。同时观察到Cystatin J转基因株系在种子萌发期间比对照株系有更高的抗盐能力。在抗病毒研究方面，转基因植株获得了具有对马铃薯Y病毒（PVY)的抗性作用。以上的研究成果表明Cystatin J基因可以用于植物抗菌、抗病毒、抗盐等的遗传改良中。