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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）是导致奶牛临床型和亚临床型乳房炎的两种常见病原微生物。在最近的研究中,长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）被发现在微生物诱导剂引发的免疫应答中发挥重要作用。然而LncRNA在牛乳腺炎中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨E.coli和S.aurues对牛乳腺上皮细胞损伤的影响,解析LncRNA在细胞损伤中的作用,并预测细胞损伤中可能的分子调控机制。另外,本研究根据LncRNA-seq以及LncRNA的MeRIP-seq的测序数据,进行基因的筛选。通过RT-qPCR实验对筛选基因进行验证,验证发现LOC104974191分子在E.coli感染的MAC-T细胞中发生了表达量的上调以及m6A修饰水平的下调。推测去甲基化酶ALKBH5是调控LOC104974191发生差异甲基化修饰的关键酶。本研究使用RT-qPCR、FISH、MeRIP-qPCR、siRNA干扰技术、过表达载体的构建及Western Blot,流式细胞术等实验方法进行验证。具体研究结果如下:1.奶牛乳腺上皮细胞体外炎症模型的建立高温灭活S.aureus与E.coli以MOI=10:1的用量刺激牛乳腺上皮细胞,刺激24 h后,使用RT-qPCR检测发现两种灭活菌均能促进IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量显著上升（p＜0.05）,表明乳腺炎体外模型的成功构建。使用CCK8检测细胞的生长活性,利用流式细胞术检测细胞ROS水平、细胞周期以及细胞凋亡率,发现灭活的金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌刺激细胞24 h后,能促进ROS过表达,细胞周期停滞,以及细胞凋亡率显著提高。2.奶牛乳腺上皮细胞中LncRNA-seq表达谱绘制及分析对乳腺上皮细胞体外炎症模型的LncRNA-seq进行数据分析。本研究在大肠杆菌刺激组中发现了 2342个差异表达的LncRNA,在金黄色葡萄球菌刺激组中发现了2313个差异表达的LncRNA。并发现在两个不同刺激组中,存在2225个相同的LncRNA有差异表达。其中大肠杆菌有268个显著性差异的LncRNA,金黄色葡萄球菌刺激组中有238个显著性差异的LncRNA,并对其进行物信息学分析,发现大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的邻近编码基因靶向的信号通路具有相似的功能,且显著性差异的LncRNA主要富集于PI3K-Akt信号通路,ErbB信号通路以及细胞紧密连接信号通路,并成功构建两个LncRNA-miRNA-mRNA相互作用网络。3.奶牛乳腺上皮细胞中整体甲基化修饰检测检测乳腺上皮细胞体外炎症模型中整体mRNA的m6A甲基化水平,发现在两种灭活菌刺激细胞24 h后,能够使得细胞整体的m6A修饰水平发生显著性的提高（p＜0.05）;同时使用RT-qPCR分别检验了 m6A修饰酶在两个刺激组中的mRNA相对表达量变化,发现甲基化酶METTL3、METTL14、WTAP的mRNA表达水平呈现显著性升高（p＜0.05）,与整体甲基化水平升高的趋势相符,而在去甲基化酶中,检测到了 ALKBH5的mRNA表达水平两种灭活菌刺激组中升高（p＜0.05）,但是FTO的表达水平在两种灭活菌刺激组未见明显差异（p＞0.05）。4.奶牛乳腺上皮细胞LncRNA MeRIP-seq修饰谱的绘制及分析对乳腺上皮细胞体外炎症模型的LncRNA的MeRIP-seq进行数据分析,发现S.aureus刺激组有112个LncRNA中存在298个差异的m6A峰;E.coli刺激组有288个LncRNA中存在920个差异的m6A峰,并且在S.aureus组和E.coli组中检测到105个相同的LncRNA的m6A峰均发生高甲基化修饰,有90个相同的LncRNA的m6A峰发生低甲基化修饰。对差异的m6A修饰的LncRNA进行功能预测,发现其主要富集于NF-κB信号通路、Wnt信号通路、mTOR信号通路等。对LncRNA-seq已经LncRNA的MeRIP-seq进行联合分析发现,在S.aureus组中有139个差异表达的LncRNA、E.coli中有20个差异表达的LncRNA,同时也发生了 m6A甲基化差异修饰,推测这些LncRNA的表达水平变化可能受到了 m6A甲基化的调控。5.长链非编码RNALOC104974191的筛选与鉴定根据LncRNA-seq以及LncRNA的MeRIP-seq的测序数据,对刺激组中发生差异甲基化修饰的LncRNA进行筛选,发现LOC104974191上的m6A修饰水平在E.coli刺激组发生显著降低。并通过使用IGV软件对其进行了甲基化峰的可视化,使用MeRIP-qPCR检测到LOC104974191分子在E.coli刺激中发生了与测序结果相符的m6A修饰水平降低（p＜0.05）。6.ALKBH5介导LOC104974191的甲基化调控牛乳腺上皮细胞凋亡（1）过表达ALKBH5能导致LOC104974191表达量下调（p＜0.05）,沉默ALKBH5能导致LOC104974191的表达量以及m6A修饰水平上调（p＜0.05）。证明ALKBH5能够影响LOC104974191的m6A修饰水平以及表达水平。（2）沉默了 LOC104974191 后 Caspase3,Cleaved-Casepase3 蛋白的表达水平升高,而PARP蛋白的表达水平降低（p＜0.05）,并且沉默LncRNA后可以促进细胞活性氧的过表达,抑制细胞活性,以及提高细胞凋亡率。证明了 LOC104974191可以促进ROS过表达,增加细胞的凋亡率。（3）沉默ALKBH5后,可以检测到Caspase3,Cleaved-Casepase3表达水平升高,而PARP蛋白的表达水平降低（p＜0.05）,并且沉默ALKBH5后可以促进细胞活性氧过表达,抑制细胞活性,以及提高细胞凋亡率。证明了 ALKBH5调控LOC104974191的m6A修饰水平,进而促进ROS过表达,最终增加细胞凋亡率。综上所述,本研究发现灭活S.aureus/E.coli刺激MAC-T细胞造成了细胞周期的停滞,ROS的过度表达,细胞活性降低以及细胞凋亡率增加,分析发现两种灭活菌刺激后整体m6A水平发生上调,以及甲基化酶METTL3、METTL14、WTAP与去甲基化酶ALKBH5的上调,并对LncRNA-seq与LncRNA的MeRIP-seq进行了数据分析,筛选出2597个差异表达的LncRNA与375个m6A差异修饰的LncRNA,并预测这些LncRNA可以参与调控信号转导与能量生成等生物学过程。本研究还证实了 ALKBH5通过调节LOC104974191的表达与m6A甲基化水平,进而促进ROS的过表达,最终促进细胞凋亡率增加及细胞生长活性降低,该研究为后续对奶牛乳腺的LncRNA相关机制研究奠定了基础。