研究背景肾癌约占成人恶性肿瘤的2%-3%,其中大部分为散发性肾癌,约4%的病例为遗传性肾癌。了解遗传性肾癌的发病机制对肾癌治疗有着重要的意义,目前已明确的遗传性肾癌包括：①VHL综合征；②遗传性乳头状肾癌；③遗传性平滑肌瘤病肾癌；④BHD(Birt-Hogg-Dube)综合征。BHD综合征是一种常染色体显性遗传病,其临床主要表现为多发性纤维毛囊瘤,多发性肺囊肿,自发性气胸及肾脏肿瘤。BHD综合征由folliculin (FLCN)基因缺失突变引起,研究表明FLCN基因位于常染色体17p11.2,编码含579个氨基酸的FLCN蛋白。FLCN蛋白与FNIP1、 FNIP2蛋白相结合,参与调节mTOR和AMPK信号通路,但其具体功能尚需进一步研究。对于BHD综合征伴发的双侧肾癌,目前尚无标准的治疗方法。2006年Youfeng Yang等建立了第一个源自BHD肾癌患者的肾癌细胞系U0K257,2011年XiaohongLu等建立了稳定表达FLCN蛋白的细胞系U0K257-2,并发现化疗药物紫杉醇对UOK257细胞的杀伤作用明显强于U0K257-2,但并未深入研究这一现象的作用机制。我们的研究结果表明,相对于高表达FLCN蛋白的肾癌细胞,紫杉醇在FLCN缺失或下调的肾癌细胞中具有更强的细胞毒性作用,并可诱导更多的凋亡和自噬现象。自噬又被称为Ⅱ型程序性细胞死亡,其特征为细胞质内出现包裹长寿命的细胞器或蛋白的双层膜结构(自噬体),并通过自噬体与溶酶体融合的途径将其分解消化的一系列生化反应。自噬对维持细胞稳态有重要的意义,在细胞遭遇饥饿等应激情况下,细胞可以通过自噬清除受损的蛋白或细胞器并维持代谢,因此自噬被认为是细胞在应激环境下所产生的一种自我保护性反应；于此同时,自噬也是细胞程序性死亡的一种方式,抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路可以明显激活肺癌细胞和肝癌细胞的自噬反应并抑制细胞生长。大量研究表明,自噬对肿瘤细胞生长产生促进或抑制作用取决于肿瘤的种类以及外界刺激等各种因素。正确的选择自噬激活剂或抑制剂,从而加强细胞的自噬性死亡或抑制细胞的保护性自噬,可以增强抗癌药物对肿瘤细胞的杀伤作用并提高对肿瘤的治疗效果,因此有必要深入研究药物对肿瘤自噬的影响,以及所诱导自噬的种类。我们的研究结果表明,紫杉醇可以诱导FLCN缺失或下调的肾癌细胞产生保护性自噬,而应用自噬抑制剂3-MA可以明显强化紫杉醇的细胞毒作用。研究表明,紫杉醇可以在不同的肿瘤细胞中诱导凋亡,但其是否能在细胞中诱导自噬尚存在争议。为了确认紫杉醇可以在FLCN缺失肾癌细胞中诱导自噬反应,我们除了应用U0K257/U0K257-2细胞外,还以肾癌细胞系ACHN作为对照,建立了FLCN表达下调的肾癌细胞系ACHN5968。我们的研究结果表明,紫杉醇可以在FLCN缺失或下调的肾癌细胞中诱导自噬,但在FLCN高表达的细胞中自噬水平无明显变化,联合应用自噬抑制剂和紫杉醇可能成为治疗BHD肾癌的一条有效途径。目的研究紫杉醇诱导的自噬现象对FLCN缺失或下调的肾癌细胞的影响及其分子机制,探讨联合应用自噬抑制剂和紫杉醇对BHD综合征伴发肾癌的治疗效果。材料与方法1.细胞本实验使用2组细胞：U0K257/U0K257-2, ACHN5968/ACHN-sct其中U0K257不表达FLCN蛋白,U0K257-2是在UOK257细胞中转染FLCN基因并稳定表达FLCN蛋白的细胞系；ACHN-sc是在肾癌细胞系ACHN中转入空白质粒的细胞,ACHN5968是利用siRNA技术将ACHN中FLCN表达下调的细胞系。2.细胞活性及细胞凋亡的测定细胞活性由MTT法测定：U0K257/U0K257-2和ACHN5968/ACHN-sc细胞种于96孔板中,实验组加入100nM紫杉醇,对照组加入等量PBS,分别在0、24、48、72小时在96孔板中加入MTT (5mg/ml)并测量其0D值。细胞凋亡由TUNEL及DAPI染色法测定。TUNEL:实验组及对照组单层细胞种于96孔板中,利用TUNEL试剂盒(HTTiterTACSTMAssay kit, TREVIGEN(?))测定凋亡细胞数量。DAPI染色：细胞经固定后,经过DAPI染色(利用1x PBS1：2000稀释),于荧光显微镜下观察并比较实验组和对照组细胞核形态。另外,本组实验还通过cleaved caspase-3蛋白的western blot结果间接比较实验组和对照组细胞凋亡差别。3.细胞自噬的检测(1)电子显微镜观察自噬体利用电子显微镜观察自噬体是检测细胞自噬的经典方法。本组实验中,U0K257/U0K257-2和ACHN5968/ACHN-sc细胞种于10cm培养皿中,实验组加入100nM紫杉醇,对照组加入等量PBS,24小时后按透射电镜标本制作要求制作标本,透射电镜下观察并拍照。电镜下自噬体特征为双层膜结构,自噬体内有时可观察到未消化的包浆成分或残存的细胞器。(2) GFP-LC3免疫荧光分析微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1light chain3,LC3)位于自噬体膜上,与自噬体数量密切相关。通过免疫荧光的方法可以观察到自噬诱导后的GFP-LC3点状聚集增多。本组实验中,各组细胞转染GFP-LC3质粒,24小时后加入100nM紫杉醇或PBS,再过24小时后于荧光显微镜下观察细胞内荧光颗粒,并计算平均每组细胞内荧光颗粒的数量。(3)单丹磺酰戊二胺荧光分析单丹磺酰戊二胺(monodansyl cadaverine, MDC)可以使自噬体发出蓝色荧光,从而成为观察自噬的一种辅助方法。本组实验中,各组细胞种于6孔板中,加入0.05mM MDC并在37℃条件下等待20分钟,然后固定细胞并于荧光显微镜下观察细胞内荧光颗粒,计算平均每组细胞内荧光颗粒的数量。(4)LC3和P62蛋白印迹分析(western blot)LC3蛋白是自噬体膜上的标记蛋白。LC3蛋白又分为LC3-I和LC3-Ⅱ两种形式,当自噬体形成后,LC3-I与磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamines,PE)结合形成LC3-Ⅱ, LC3-Ⅱ位于自噬体膜上,并最终随自噬体被溶酶体降解。在实际实验中,药物诱导后的LC3-Ⅱ蛋白表达升高可以由自噬水平升高引起,但也可能由溶酶体功能受到抑制且自噬水平降低引起,为区分这两种原因,一般先用溶酶体抑制剂处理细胞,然后再检测药物诱导后的LC3-Ⅱ蛋白水平。本组实验中,利用蛋白印迹方法检测并比较各组细胞内LC3-Ⅱ蛋白含量,并利用溶酶体抑制齐bafilomycin Al处理细胞后,再次检测细胞内LC3-Ⅱ蛋白含量。另外,本组实验还检测各组细胞中P62蛋白含量,以进一步证实细胞内自噬反应。4.ERK信号通路的检测本组实验利用蛋白印迹方法检测MEK, ERK及P-ERK蛋白水平,从而确定ERK信号通路的激活是紫杉醇诱导缺乏FLCN表达的肾癌细胞产生自噬的关键机制。本组实验检测了各组细胞中FLCN,MEK,ERK,P-ERK,LC3-Ⅰ/Ⅱ及beclin-Ⅰ蛋白表达水平,并应用P-ERK抑制剂U0126处理细胞后,再次检测P-ERK, LC3-Ⅰ/Ⅱ及beclin-I蛋白表达变化。5.自噬功能的检测为了判定细胞自噬对紫杉醇毒性的影响,本组实验分别利用自噬抑制剂和基因沉默技术抑制自噬,观察并比较自噬抑制前后紫杉醇对细胞毒性作用的变化。各组细胞经自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)处理或转染beclin1siRNA后,检测自噬相关蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ表达变化,并利用MTT和TUNEL方法比较自噬抑制前后紫杉醇对细胞毒性作用的变化。6.统计学分析本课题利用SPSS软件包对各组实验数据进行方差分析或t检验。所有数值用平均值±标准差表示。p<0.05表示具有显著性差异。结果1.紫杉醇对细胞活性及凋亡的影响经紫杉醇处理后,U0K257/U0K257-2和ACHN5968/ACHN-sc细胞的细胞生长均受到抑制,与对照组细胞(U0K257-2、 ACHN-sc)相比, FLCN缺失或下调的细胞(UOK257、ACHN5968)生长曲线下降更为明显。TUNEL和DAPI染色结果显示,加入紫杉醇后,与U0K257-2和ACHN-sc相比,U0K257和ACHN5968细胞凋亡更加明显,且凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3有显著升高。以上实验结果表明,与高表达FLCN的肾癌细胞相比,紫杉醇可以在FLCN缺失或下调的细胞中诱导更明显的细胞凋亡和生长抑制。2.紫杉醇对细胞自噬的影响经紫杉醇处理后,U0K257-2和ACHN-sc细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达无明显变化,而U0K257和ACHN5968细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达明显升高；经溶酶体抑制剂bafilomycin Al处理后各组细胞的LC3-Ⅱ表达均有所升高,相比于U0K257-2和ACHN-sc细胞,U0K257和ACHN5968细胞中LC3-Ⅱ蛋白升高更加明显。GFP-LC3和MDC分析结果显示,与UOK257-2和ACHN-sc细胞相比,经紫杉醇处理后U0K257和ACHN5968细胞内可见荧光点状聚集显著增加(p<0.05),电子显微镜下可见UOK257和ACHN5968细胞内出现较多的自噬体。以上实验结果证明,紫杉醇可以在FLCN缺失或下调的肾癌细胞内诱导明显的自噬现象。3.紫杉醇诱导自噬的分子机制western blot结果表明,FLCN蛋白参与MAPK信号通路的调节。与U0K257-2和ACHN-sc相比,U0K257和ACHN5968细胞内ERK信号通路被明显激活,通路关键蛋白P-MEK和P-ERK都有显著升高。根据文献报道,ERK信号通路可以通过调节自噬相关蛋白Beclin-1的表达进而影响细胞自噬,本组实验中,紫杉醇可以进一步升高U0K257和ACHN5968细胞中P-ERK和Beclin-1蛋白水平,而利用U0126抑制P-ERK表达后,细胞内Beclin-1和LC3-Ⅱ水平均有明显下降,GFP-LC3实验结果显示细胞内荧光点状结构数目明显减少。本组实验结果证明,紫杉醇可以在FLCN缺失或下调的肾癌细胞内激活ERK通路并升高Beclin-1蛋白表达,进而诱导细胞自噬。4.自噬对紫杉醇药效及细胞生长的影响经自噬抑制剂3-MA处理细胞后,紫杉醇未能在U0K257和ACHN5968细胞中诱导自噬,加入紫杉醇后细胞LC3-Ⅱ水平无明显改变。MTT和TUNEL结果显示,加入3-MA后,紫杉醇对UOK257和ACHN5968细胞的毒性作用明显增强,并能在细胞内诱导更明显的凋亡。利用基因沉默技术抑制自噬可以得到相似的结果,通过下调Beclin-1蛋白表达抑制自噬后,U0K257和ACHN5968细胞对紫杉醇更加敏感。本组实验结果表明,紫杉醇可以在杀伤UOK257和ACHN5968肾癌细胞的同时诱导细胞内出现保护性自噬,联合应用紫杉醇和自噬抑制剂可能会对BHD伴发的肾癌有更明显的治疗效果。结论1.与高表达FLCN的细胞相比,紫杉醇对FLCN缺失或下调的肾癌细胞有更明显的细胞毒作用。2.紫杉醇在FLCN缺失或下调的细胞内激活ERK通路并上调Beclin1蛋白表达,进而诱导细胞自噬。3.抑制自噬可以增强紫杉醇对FLCN缺失或下调的肾癌细胞的毒性作用,联合应用自噬抑制剂和紫杉醇可能成为治疗BHD相关性肾癌的有效途径。研究意义及创新性1.本课题实验结果首次表明紫杉醇可以在FLCN缺失或下调的肾癌细胞中诱导自噬,并进一步揭示了紫杉醇诱导自噬的分子机制为ERK通路的激活以及Beclin1蛋白表达的增强。2.本课题结果表明抑制自噬可以增强紫杉醇对FLCN缺失或下调的肾癌细胞的细胞毒作用,并提出联合应用自噬抑制剂和紫杉醇可能会成为治疗BHD相关性肾癌的有效途径。研究背景肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,大约有25%-30&的肾癌患者在初次诊断时就已发现有局部浸润或远处转移。局限性肾癌首选治疗方法为根治性肾切除术,但术后约1/3患者将出现远处转移。晚期肾癌预后较差,对放疗和化疗都不敏感。尽管最近有文献报告重离子放疗可能对肾癌有较好的治疗效果,但目前临床上放疗仅被用作肾癌治疗的辅助方法。研究表明肾癌的发生可能与部分抑癌基因如VHL, FLCN, MET等基因功能丧失有关,其中FLCN基因缺失常诱发BHD综合征,患者可伴有双侧肾肿瘤,而针对FLCN基因缺陷的肾肿瘤目前尚无有效的治疗方法。本课题研究发现,相较于其他类型的肾癌细胞,FLCN缺失的肾癌细胞对γ线放射更加敏感,且在经受放射后细胞内出现更明显的自噬现象。自噬是一种正常的细胞内生化反应,可以在细胞经受饥饿等生存压力时为细胞提供能量和营养成分。在肿瘤细胞中自噬水平可能出现异常,并根据细胞种类和外界刺激的不同,出现导致细胞生命力增强或者启动细胞程序性死亡这两种截然相反的结果。目前自噬在肿瘤治疗中的应用是热门研究领域之一,而自噬对肿瘤放疗敏感性的影响尚未清楚。在多项体外实验中,自噬抑制剂氯喹可以明显增强肿瘤对放疗的敏感性,但也有研究表明放疗可以通过激活细胞的自噬性死亡杀伤肿瘤细胞,如Selvakumar Anbalagan等研究发现γ线放射可以在VHL基因缺陷的肾癌细胞中诱导自噬,而利用自噬诱导剂可以增强肾癌细胞对放疗的敏感性。为了检测Y线放射对FLCN基因缺陷肾肿瘤的治疗效果,本实验比较FLCN缺失的肾癌细胞与其他类型肾癌细胞对γ线放射的敏感性差别,并检测FLCN缺失或下调的肾癌细胞与对照组细胞在经过γ线放射后凋亡及自噬水平上的差别。根据抑制或进一步激活自噬后细胞对γ线放射敏感性的变化,进一步确定自噬对FLCN基因缺失的肾癌细胞放疗敏感性的影响。目的1.检测FLCN缺失的肾癌细胞对Y线放射的敏感性。2.在经过γ线放射后,检测FLCN缺失或下调的肾癌细胞与高表达FLCN的肾癌细胞在凋亡及自噬水平上的差别。3.检测自噬对FLCN基因缺失或下调的肾癌细胞放疗敏感性的影响。4.检测γ线放射在FLCN基因缺失或下调的肾癌细胞中诱导自噬的分子机制。材料和方法1.细胞为确定FLCN对肾癌γ线放射敏感性的影响,本实验使用ACHN,786-0,769-P, Caki-1和UOK257五种人肾癌细胞进行γ线放射后的克隆存活分析实验。为检测自噬对FLCN基因缺失或下调的肾癌细胞γ线放射敏感性的影响,本实验使用2组细胞：UOK257/UOK257-2, ACHN5968/ACHN-sc。其中UOK257是源自BHD综合征患者的FLCN基因缺失的肾癌细胞系,UOK257-2是利用基因转染技术建立的稳定表达FLCN的细胞系；ACHN5968是利用siRNA技术将肾癌细胞系ACHN中FLCN表达下调的细胞系,ACHN-sc是在ACHN中转入对照空白质粒的细胞。2.克隆存活分析实验ACHN,786-0,769-P, Caki-1和UOK257细胞种于6cm细胞培养皿中,经过OGy、1Gy、3Gy和5Gy的γ线放射后,在正常细胞培养条件下培养14天,形成的细胞克隆经0.5%的结晶紫染色后计数。为进一步检测FLCN对肾癌细胞放疗敏感性的影响,将2组细胞UOK257/UOK257-2, ACHN5968/ACHN-sc种于6cm细胞培养皿中,经过OGy、1Gy、3Gy、5Gy和7Gy的γ线放射后,再次进行细胞克隆的培养、染色和计数。根据实验结果计算各组细胞的细胞生存指数(Surviving fraction, SF):SF=平均细胞克隆数／初始细胞种植数×种植效率(plating efficiency, PE), PE=无放射对照组平均细胞克隆数／无放射对照组初始细胞种植数。3.γ线放射对细胞凋亡的影响细胞凋亡由TUNEL法测定：将UOK257/UOK257-2, ACHN5968/ACHN-sc单层细胞种于96孔板中,经OGy、3Gy和5Gy的γ线放射后,利用TUNEL试剂盒测定凋亡细胞数量。提取放射后各组细胞总蛋白,利用western blot方法检测cleaved caspase-3蛋白含量,进而间接比较实验组和对照组细胞凋亡差别。4.丫线放射后细胞自噬的检测细胞自噬通过MDC、GFP-LC3荧光分析以及LC3蛋白印迹分析三种方法检测。IMDC荧光分析：各组细胞种于6孔板中,经OGy、3Gy、5Gy的γ线放射后于正常培养条件下等待7小时,加入0.05mM MDC并在37℃条件下等待20分钟,固定细胞后利用荧光显微镜观察并计数细胞内荧光颗粒数量。GFP-LC3荧光分析：各组细胞转染GFP-LC3质粒,24小时后细胞经OGy、3Gy和5Gy的Y线放射并于正常培养条件下等待7小时,利用荧光显微镜观察并计数细胞内荧光颗粒数量。LC3蛋白印迹分析：各组细胞经γ线放射后于正常培养条件下等待7小时,提取细胞总蛋白,经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白转膜及抗体结合,观察比较各组细胞内LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白含量。5.检测自噬对细胞γ线放射敏感性的影响利用自噬抑制剂或基因沉默技术抑制细胞自噬后,对各组细胞进行γ线放射,通过克隆存活分析实验比较自噬抑制组和对照组细胞的生存指数曲线。为进一步证实自噬对细胞丫线放射敏感性的影响,本实验使用自噬诱导剂雷帕霉素处理细胞,并观察比较自噬诱导组和对照组细胞经γ线放射后的生存指数曲线。6.自噬分子机制的检测为探讨γ线放射在FLCN缺失的肾癌细胞中诱导自噬的分子机制,本实验利用western blot检测ERK信号通路的关键蛋白ERK/P-ERK,以及自噬调节蛋白Bceclin1,并利用基因沉默技术抑制细胞内Bceclin1蛋白表达后,再次检测经γ线放射后细胞自噬的变化。7.统计学分析本组实验利用SPSS软件包对各组实验数据进行方差分析或t检验。所有数值用平均值±标准差表示。p<0.05表示具有显著性差异。结果1.FLCN降低肾癌细胞对γ线放射的敏感性ACHN,786-0,769-P,Caki-1和UOK257五种人肾癌细胞中,ACHN细胞内FLCN蛋白含量最高,UOK257不表达FLCN蛋白。克隆存活分析实验结果显示,经γ线放射后,ACHN细胞生存指数最高,UOK257细胞生存指数最低,表明FLCN可以降低肾癌细胞对γ线放射的敏感性。2. FLCN增加丫线放射后肾癌细胞的凋亡对UOK257/和UOK257-2,ACHN5968/ACHN-sc两组细胞进行γ线放射后,TUNEL实验结果显示所有细胞中凋亡细胞数量均有所增加,而相较于FLCN缺失或下调的细胞(UOK257.ACHN5968),高表达FLCN的细胞(UOK257-2.ACHN-sc)凋亡更加明显(p<0.05)。Western blot结果显示,经γ线放射后,UOK257-2和ACHN-sc细胞内cleaved caspase-3蛋白表达明显高于UOK257和ACHN5968细胞,间接证明经γ线放射后高表达FLCN的细胞凋亡更加明显。3.FLCN对γ线放射后肾癌细胞内自噬的影响对UOK257/UOK257-2,ACHN5968/ACHN-sc两组细胞进行γ线放射后,MDC和GFP-LC3结果均显示UOK257和ACHN5968细胞内荧光颗粒数量高于UOK257-2和ACHN-sc细胞,表明相较于高表达FLCN的细胞,丫线放射可以在FLCN缺失或下调的细胞中诱导更明显的自噬。LC3-Ⅰ/Ⅱ的western blot结果显示,与UOK257-2和ACHN-sc细胞相比,γ线放射后UOK257和ACHN5968细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高,再次证明γ线放射在FLCN缺失或下调的细胞中诱导更明显的自噬现像。4.检测自噬对细胞γ线放射敏感性的影响利用自噬抑制剂3-MA处理细胞后,各组细胞在经γ线放射后LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表达无明显变化,显示自噬被成功抑制。当自噬被抑制后,UOK257和ACHN5968细胞对γ线放射的敏感性明显降低,而UOK257-2和ACHN-sc细胞对γ线放射的敏感性无明显改变；利用基因沉默技术抑制beclin-l蛋白表达进而抑制细胞自噬后,可得到相似的实验结果,显示自噬可以升高FLCN缺失或下调的肾癌细胞对γ线放射的敏感性。本实验利用自噬诱导剂雷帕霉素处理UOK257和ACHN5968细胞后,细胞内LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表达明显升高,且细胞对γ线放射的敏感性明显升高,表明自噬诱导剂可以增强FLCN缺失或下调的肾癌细胞对γ线放射的敏感性。5.自噬分子机制的检测Western blot结果表明,在肾癌细胞中,FLCN蛋白可以下调ERK信号通路关键蛋白P-ERK的表达。经过γ线放射后,UOK257和ACHN5968细胞内P-ERK和Beclin1蛋白明显升高,而利用基因沉默技术抑制Beclin1蛋白表达后,丫线放射未能在U0K257和ACHN5968细胞中诱导自噬,表明γ线放射通过激活ERK信号通路并上调Beclin1蛋白表达从而在FLCN缺失或下调的肾癌细胞中激活自噬反应。结论1. FLCN可以降低肾癌细胞对γ线放射的敏感性,无FLCN表达的UOK257肾癌细胞对丫线放射较敏感。2.相对于高表达FLCN的细胞,γ线放射可以在FLCN缺失或下调的肾癌细胞中诱导更明显的自噬反应。3.自噬可以升高FLCN缺失或下调的肾癌细胞对γ线放射的敏感性,应用自噬诱导剂雷帕霉素可以增强γ线放射对UOK257和ACHN5968细胞的杀伤作用。4.γ线放射通过激活ERK信号通路并上调Beclin1蛋白表达从而在FLCN缺失或下调的肾癌细胞中激活自噬反应。研究意义及创新性1.本实验结果首次表明FLCN可以降低肾癌细胞对γ线放射的敏感性,且相对于高表达FLCN的细胞,γ线放射可以在FLCN缺失或下调的肾癌细胞中诱导更明显的自噬反应。2.本实验结果表明应用自噬诱导剂雷帕霉素可以增强γ线放射对FLCN缺失或下调的肾癌细胞的杀伤作用,并提出联合应用自噬诱导剂和γ线放射可能会对BHD相关性肾癌具有较好的治疗效果。