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本文针对乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染临床诊断及监测领域的两个重要问题进行探讨,共由两部分研究组成。
共中第一部分旨在研究隐匿隆GBV感染形成的分子病毒机制。隐匿性HBV感染(Occult RBV Infection,OBI)是指血清HBsAg检测阴性但肝内或血清HBVDNA的一种特殊感染状态。由于不能被常规检测手段有效检出,OBI感染者捐献的血液及器官是造成HBV经血或经器官移植传播的重要潜在威胁。尽管OBI感染者的病毒复制多处于静息或潜伏状态,但具原发性肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma,HCC)的发生风险,并可能是部分隐源性肝病的重要病因。这些患者可因为接受化学治疗、放射治疗或免疫抑制治疗而使HBV再激活造成致命的爆发性肝炎。OBI产生的机制目前尚不完成清楚,可能与病毒变异及宿主免疫状态等因素有关。既往研究表明,HBV S蛋白膜外主要亲水区(Major hydrophilicregion,MHR)的氨基酸变异与OBI高度相关,推测MHR变异可改变S蛋白的抗原性,使得变异的HBV不能被试剂抗体有效结合,导致HBsAg检测阴性。然而,新近研究发现多数OBI即使用当前最为敏感的HBsAg试剂仍然无法检出,提示可能存在其他的机制在维系OBI与MHR变异这一联系中起到作用。对上述问题的深入认识,有赖于全面评估MHR变异对HBsAg抗原性及病毒功能表型的影响。
通过对我国多个地区临床慢性肝病病人(n=3,419)和厦门地区无偿献血者(n=38,499进行OBI筛查,本研究对我国流行的隐匿性HBV病毒的分子特征进行了初步研究,重点研究了其中HBsAg MHR变异株的流行情况,较为全面地研究了OBI中13种代表性MHR变异对HBsAg抗原性及多种试剂检测能力的影响,并在Huh7细胞和小鼠动物模型中评估了这些变异对病毒功能表型的影响。
研究结果表明,我国流行的基因型B和C的OBI中,MHR变异株携带率在50％左右,显著高于HBsAg阳性感染者(10％-30％,p＜0.001)。在HBV感染献血员中,感染者(包括HBsAg阳性感染者和OBI感染者)血清HBsAg及HBVDNA水平与MHR变异率呈负相关。OBI中的MHR氨基酸变异是多样的,未发现特异的规律性变异,散在的变异多见于“a”表位(aa124-aa147)及“a”前的区域aa110-aa124,而少发于“a”表位后的区域(aa147-aa160),其中G145R(11/122)、T140I(9/122)及MHR内的Cys替换(9/122,如C124R/Y、C139R等)发生频率相对较高。
采用针对A-G七类表位的共30株Anti-HBs单抗对13种OBI代表性MHR变异株进行抗原性分析发现,HBsAg上的1st-loop N端表位(aa121-aa127附近)与2nd-loop表位(aa137-aa151附近)的抗原性是相互独立的,1st-loop N端变异(G119R、P120T、C124R/Y)不影响2nd-100p表位抗体(E/F类)的活性;2nd-loop的变异(K141E、D144A、G145A/R)也不影响1st-loop N端抗体(A类)的结合。1st-loop C端抗体(G类)的活性则同时1st-loop N/C端和2nd-loop变异的影响。识别膜内亲水区(aa57-aa79)的抗体,活性不受MHR变异的影响。总体上,MHR变异对构象抗体的影响大于线表位抗体。HBV感染应答和(或)疫苗免疫应答的人Anti-HBs多抗对除S136P和1126S外的变异病毒反应均有不同程度的下降,尤其对G119R、C124R/Y、K141E和G145R降低最为显著。研究中涉及的七种HBsAg试剂对4种变异病毒(C124R/Y、K141E、D144A)的分析灵敏度显著下降。在Huh7细胞和HBV尾静脉高压小鼠模型进行的研究表明,13种MHR变异均不对病毒的复制、转录和各种病毒蛋白表达造成明显影响,但包括G119R、C124Y、1126S、Q129R、S136P、C139R、T140I、K141E、D144A和G145R在内的10种变异显著下调了病毒颗粒和S蛋白的分泌水平。
上述研究结果表明S蛋白MHR变异可能通过两种机制导致OBI形成,一是改变HBsAg的抗原性,影响HBsAg试剂检测性能导致漏检;二是降低变异病毒的分泌能力,导致血清HBsAg和HBV DNA低水平,使之不易被检出。
本文第二部分旨在探索乙型肝炎病毒核心抗体定量水平的临床意义。乙型肝炎病毒核心抗体(Antibody against hepatitis B core protein,Anti-HBc)是五个经典HBV血清学指标之一,在HBV感染早期即可在血清中检测到,常持续存在终身。一直以来,Anti-HBc定性检测是判断个体是否曾被HBV感染的重要指标。理论上,Anti-HBc作为宿主针对HBV衣壳蛋白(HBcAg)的B细胞应答产生的抗体,其水平可能与宿主免疫状态有关。但长期以来,受方法学限制,Anti-HBc水平的定量测定在临床上及医学研究中均极少进行,其临床意义一直未被很好地揭示。从定量角度对Anti-HBc进行再认识,或有利于为慢性乙型肝炎(chronichepatitis B.CHB)发现新的预警预测指标,并有助于对CHB自然历史过程的深入理解。
在本研究中,我们建立了Anti-HBc双抗原夹心定量检测方法。以此为技术手段,首先通过在既往HBV感染者(n=350)、慢性HBV感染不同自然历史时期的感染者(n=488)及隐匿性HBV感染者(n=101)中的横断面研究,较为全面地分析了HBV感染不同阶段的Anti-HBc水平分布。接着在未经治疗的CHB患者自然进展纵向队列(n=9,平均随访103±38周,每例随访5-17次)中研究了Anti-HBc水平的动态变化。并进一步在接受96周-阿德福韦酯(ADV,n=49)和24周-长效干扰素治疗(PegIFN,n=48)的HBeAg阳性CHB患者队列中评估了基线Anti-HBc水平预测治疗应答的价值。
研究发现,HBV感染不同时期的Anti-HBc水平有显著差异(p＜0.001)。既往HBV感染者(PBI)、ALT＜ULN的OBI(n=65)、ALT＞ULN的OBI(n=36)、CHB免疫耐受期(IT,n=52)、免疫清除期(IC,n=104)、低复制期(LR,n=75)、HBeAg阴性的肝炎期(ENH,n=85)、肝硬化期(LC,n=63)和肝癌期(HCC,n=109)的Anti-HBc水平中位值分别为0.4、0.9、1.4、3.4、4.4、3.3、4.4、4.1和4.1 log10 IU/nlL。证实CHB患者血清Anti-HBc水平与ALT水平和宿主免疫状态高度相关,在ALT≤5×ULN慢性HBV感染者中,Anti-HBc与ALT水平呈现正相关(单因素分析:r=0.52,p＜0.001:多因素分析:R=0.53,p＜0.001);在ALT＞5XULN慢性HBV感染者中,Anti-HBc平均水平达到最高平台值,Anti-HBc与ALT失去相关性(p=0.43)。此种相关性独立于感染者的年龄、性别、HBeAg状态、HBV DNA水平、HBV基因型及疾病阶段。在CHB患者自然进展过程中,免疫耐受期患者的Anti-HBc可恒定处于低水平,在肝炎活动时,ALT与Anti-HBc几乎同时升高,前者通常比后者早3-8周达到峰值,但在某些情况下,Anti-HBc也可能先于或与ALT同时达到峰值。在肝炎恢复期,Anti-HBc在ALT复常后12-20周方能回到基线水平。
在接受ADV和PeglFN治疗的HBeAg阳性病人中,基线Anti-HBc水平能有效预测治疗后HBeAg血清学转换应答情况,AUROC分别为0.810(95％CI:0.675-0.948,p=0.004)和0.710(95％CI:0.564-0.855,p=0.013)。基线Anti-HBc水平高的病人(ADV治疗病人≥29.000 IU/Ml:PeglFN治疗病人≥9.000 IU/Ml)较基线Anti-HBc水平者治疗后(随访终点)HBeAg血清学转换率更高(ADV治疗病人:RR=7.22,95％CI:1.69-30.9,p=0.006;PegIFN治疗病人:RR=2.10,95％CI:1.06-4.17.p=0.021)。
综上所述,本研究表明CHB患者的Anti-HBc水平与ALT水平及药物治疗应答高度相关,或可作为衡量CHB患者宿主Anti-HBV免疫应答能力替代指标。上述发现初步探索并诠释了Anti-HBc这一经典HBV血清学指标的临床新意义,非常值得进一步验证和研究。