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植物在受到病原菌侵染或者一些非生物胁迫时会大量分泌一种参与协同防御的蛋白,即病程相关蛋白(Pathogenesis related proteins, PRPs)。 PRPs广泛分布于多种植物中。根据其氨基酸序列和血清学关系等,PRPs被分为17个亚类(PR1-PR17).病程相关蛋白第5家族,即PR-5类蛋白,是一类与甜味蛋白(Thaumatin)高度同源的类甜蛋白,具有抗真菌、p-1,3-葡聚糖酶、淀粉酶抑制剂等多种活性。目前已从植物、节肢动物、甚至真菌中发现了100多种PR-5类蛋白。实验室前期从莜麦种子中分离得到的一种具有抗真菌活性的蛋白Permatin, Permatin的分子量大小为23 kDa,经质谱鉴定属于PRPs的第五家族蛋白(PR-5类)。Permatin蛋白可以抑制毛壳菌、木霉、白腐菌的生长,具有明显的抗真菌活性。本文对Permatin蛋白的抗真菌机理进行了初步的分析。首先利用固体平板带毒滤纸片法和形态观察法分别分析了Permatin蛋白对镰刀菌、青霉及酵母等的生长抑制性。利用膜染料FM1-43染色和DAPI染色,在Delta vision荧光显微镜下观察了Permatin蛋白对镰刀菌和酵母细胞形态学影响,结果显示Permatin蛋白可以引起镰刀菌菌丝体和酵母细胞的膜壁裂解破碎,内容物外渗等异常形态变化。其次将去掉信号肽的permatin (22-225aa)基因片段克隆到pET-32L-3C载体上并在进行了大肠杆菌上进行了重组表达及纯化。利用甲醇-氯仿法萃取了镰刀菌的膜脂,通过荧光光谱技术和圆二色对Permatin和真菌膜脂的结合能力进行评价,并用PIP StripsTM脂质膜免疫印迹检测与Permatin相互作用的膜脂成分。结果表明,Permatin与真菌膜脂具有相互作用,且主要与膜脂中的磷脂酰肌醇相互作用。最后利用荧光探针DCFH-DA在荧光显微镜和荧光分光光度计下检测了Permatin蛋白对镰刀菌和酿酒酵母细胞的活性氧含量影响,结果显示Permatin可以引起真菌体内的活性氧水平显著升高。综上结果,Permatin蛋白可以结合到真菌的细胞膜上,并通过与细胞膜上的特异性磷脂成分相互作用,引起细胞膜的裂解破碎,此外Permatin在裂解真菌细胞膜的过程中引起真菌细胞内活性氧的爆发,致使细胞体内氧化损伤,最终致使真菌死亡