论文部分内容阅读
Lj—RGD3为来自于七鳃鳗口腔腺的含有三个RGD模体的毒素蛋白，其除具有RGD模体这一典型RGD毒素蛋白特征外，还与富含组氨酸糖蛋白HRG具有序列同源性。由于RGD毒素蛋白及HRG都具有抑制血管新生的活性，但作用靶点不同，为了研究Lj—RGD3结构与功能的关系，本文对野生型Lj—RGD3进行了RGD模体缺失突变，包括：三个RGD的全缺失突变体Lj—112；仅保留第1位RGD的突变体Lj—113；仅保留第2位RGD的突变体Lj—114；仅保留第3位RGD的突变体Lj—115；将三个RGD全部突变为KGD的突变体Lj—116。本课题对上述突变体蛋白与野生型之间进行了生物学活性的比较，以确定其结构与功能的关系。具体方法为：将突变基因全序列合成后构建于pET—23b载体，对各蛋白进行IPTG诱导表达，经组氨酸亲和层析纯化。MTT结果表明，rLj—RGD3与各突变体蛋白均以剂量依赖方式抑制bFGF诱导的ECV304细胞增殖，rLj—RGD3的IC50为0．889μmol/L，rLj—112的IC50为0．160μ mol/L，rLj—113的IC50为0．215μ mol/L，rLj—114的IC50为0．143μmol/L，rLj—115的IC50为0．150μ mol/L，rLj—116的IC50为0．529μ mol/L。运用鸡绒毛尿囊膜(CAM)模型结果显示，rLj—RGD3与各突变体蛋白均能抑制CAM的血管新生，且同等剂量条件下rLj—112的作用较强。采用Transwell细胞培养板检测各蛋白对bFGF诱导下细胞迁移的抑制作用，结果表明，rLj—RGD3与突变体蛋白rLj—112、rLj—113、rLj—114、rLj—115和rLj—116均能抑制ECV304细胞的迁移，抑制率分别为50％、63％、42％、65％、70％和40％。利用人工基质膜基质Matrigel及Transwell模仿体内环境研究rLj—RGD3与五种突变体蛋白对ECV304细胞浸涧的抑制作用，结果显示，以bFGF为趋化剂的ECV304细胞穿透№trigel的浸润行为均明显受到抑制，且rLj—112的抑制功能较强。整合素连接激酶ILK—1的ELISA实验结果表明，rLj—RGD3与五种突变体蛋白均能下调ECV304细胞ILK—1的表达。上述结果表明，野生型rLj—RGD3与其五种不同的突变体蛋白rLj—112、rLj—113、rLj—114、rLj—115和rLj—116均具有抑制血管新生功能，且突变体Lj—112的活性相对于野生型和其他突变体蛋白较高，这说明Lj—112为HRG功能蛋白，而野生型Lj—RGD毒素蛋白与HRG序列的同源性并未使野生型抗血管新生功能得到协同加强，二者的抗血管新生功能涉及了不同的信号通路。而Lj—RGD3不同位置RGD缺失突变体的血管新生抑制功能均强于野生型的结果也表明，Lj—RGD3的三个RGD模体间的抗血管新生功能也不是协同加强的，这其中的机制应与类HRG蛋白的信号通路有关。