目的利用Flexcell-5000细胞力学加载系统构建人牙周膜成纤维细胞(Human periodontal ligament fibroblasts,h PDLFs)体外培养-周期性牵张力加载模型,观察h PDLFs在周期性牵张力作用下细胞骨架、增殖活性、骨形成蛋白9(BMP9)及相关成骨标志蛋白的表达变化,研究在周期性牵张力介导下BMP9是否激活PI3K/AKT信号通路调控h PDLFs成骨分化。方法本研究将体外培养的h PDLFs随机分为3个实验组和1个对照组,实验组利用Flexcell-5000细胞力学加载系统加载形变率为10%、频率为0.5Hz的周期性牵张力,作用时间分别为6h、12h和加入PI3K信号通路抑制剂LY294002后作用12h,对照组不加力。倒置相差显微镜下观察h PDLFs生长状态;免疫荧光实验检测细胞骨架蛋白的表达;流式细胞术检测h PDLFs增殖情况;利用碱性磷酸酶(ALP)活性检测方法检测h PDLFs ALP活性;实时荧光定量PCR检测RUNX2、OCN、OPN、OSX m RNA的表达情况;Western blot检测骨形成蛋白BMP9和成骨标志蛋白OCN、OPN的蛋白表达情况,加入PI3K信号通路抑制剂LY294002后检测AKT、P-AKT蛋白表达变化以及成骨标志蛋白OCN、OPN的蛋白表达变化;茜素红染色检测h PDLFs成骨分化骨钙盐结节形成情况。结果接种到Bioflex六孔培养板中的h PDLFs,细胞贴壁良好,周期性牵张力作用后h PDLFs生长状态良好,排列有序与加力方向一致,细胞骨架蛋白的表达明显增多。流式细胞术检测显示S期细胞所占的比例6h组、12h组分别与对照组比较均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);ALP活性表达6h组、12h组分别与对照组比较均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);实时荧光定量PCR检测RUNX2、OCN、OPN、OSXm RNA的表达6h组、12h组分别与对照组比较均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot检测BMP9和成骨标志蛋白OCN、OPN的表达6h组、12h组与对照组比较均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),加入PI3K信号抑制剂LY294002后AKT激酶的磷酸化水平降低,成骨标志蛋白OCN、OPN的表达水平也明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);茜素红染色显示6h组、12h组体外培养21d后细胞中有骨钙盐结节形成,且形成量均较对照组明显增多。结论1、本实验利用Flexcell-5000细胞力学加载系统加载形变率为10%、频率为0.5Hz的周期性牵张力作用于体外培养的h PDLFs,h PDLFs生长状态良好,成功构建h PDLFs体外培养-周期性牵张力加载模型。2、周期性牵张力促进了h PDLFs成骨分化。3、周期性牵张力可以通过BMP-PI3K/AKT信号通路调控h PDLFs成骨分化。