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HIV-1整合酶是由HIV-1病毒pol基因编码的分子量为32kDa的蛋白质，能够介导病毒DNA与宿主染色体的整合，是病毒复制周期中必不可少的环节，抑制整合酶能够有效阻止病毒在体内复制。同时，人体细胞中无整合酶的功能类似物，因此，整合酶是抗HIV-1的理想靶点。HIV-1整合酶在体内通过催化3’端加工和链转移两步反应，实现病毒DNA与宿主基因组的整合。整合酶通过特异性地识别病毒DNA LTR的CAGT-3’序列，切除末端的GT二核苷，暴露出高度保守的CA-OH3’，病毒cDNA的3’端腺苷酸通过转脂反应以3’-OH同宿主DNA切口的5’端的磷酸基团形成新的磷酸二酯键，实现共价结合。晶体结构研究显示：整合酶由三个结构域组成：1、N端结构域：包含锌指结构，能够促进整合酶的四聚化，影响C端区与病毒cDNA的结合；2、核心结构域：是整合酶发挥功能的关键区域，三个高度保守的酸性氨基酸残基：Asp64，Asp116和Glu152为酶的活性中心，能够结合二价金属阳离子(Mg2+/Mn2+)，形成DD3sE型结构：3、C端结构域：其主要功能是非特异性结合DNA，介导蛋白质分子内和分子间的相互作用。因为以前普遍采用的方法使用带有放射性标记的病毒DNA底物，和整合酶共育后，经过变性胶电泳以及放射自显影，显示整合酶的反应产物。但这种实验具有耗时较长及放射线污染的缺点。为了克服以上缺点，本实验分别采用基于磁珠的酶联免疫吸附试验方法(ELISA)及基于荧光的分子信标法鉴定整合酶3’端加工和链转移的反应活性，并研究其反应特性。根据计算机模拟结果，设计可能为整合酶关键残基的突变位点，以HIV-1 B亚型国际标准株pol基因为模板克隆出整合酶基因，将其插入pET28a(+)原核表达载体。通过重叠PCR方法将第188位赖氨酸突变为谷氨酸(K188E)，第189位甘氨酸突变为丝氨酸(G189S)，构建了HIV-1整合酶突变体pET28a(+)/IN(K188E/G189S)，为后续研究病毒DNA-整合酶间相互作用打下实验基础。
本研究用pET28a(+)IN(F185K/C280S)表达载体在大肠杆菌中高效表达HIV-1整合酶；采用亲和层析技术纯化HIV-1 IN(F185K/C280S)蛋白质；利用基于荧光的分子信标法研究病毒DNA-整合酶间相互作用特性。在Eocli BL21(DE3)中进行可溶性表达HIV-1 IN(F185K/C280S)，通过镍柱纯化，获得高纯度及可溶的整合酶蛋白。采用基于磁珠的酶联免疫吸附试验方法鉴定整合酶的3’端加工和链转移反应活性，利用基于荧光的分子信标法对病毒DNA-整合酶间相互作用进行反应特性分析。根据计算机模拟结果，对整合酶核心区域的第188位和第189位氨基酸残基进行突变实验，构建HIV-1整合酶突变体pET28a(+)/IN(K188E/G189S)。经过表达和纯化，得到了较纯的整合酶蛋白，在整合酶活性鉴定实验中，我们表达和纯化的整合酶蛋白表现出较好的生物学活性。根据计算机模拟结果，成功构建HIV-1整合酶突变体pET28a(+)/IN(K188E/G189S)。