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在固体培养基中,链霉菌具有复杂的形态分化周期(由营养生长到气生菌丝的产生,直至孢子的形成),紧密伴随的是代谢上由初级代谢到次级代谢的转变(又称生理分化)。本论文依据研究材料的不同分为两部分内容,第一部分研究内容为:圈卷产色链霉菌中形态分化、初级代谢和次级代谢过程相关基因的功能研究。
sawC是圈卷产色链霉菌中与天蓝色链霉菌whiA同源的基因;sawC基因阻断突变株的表型特征和whiA突变株表型一致,都停留在气生菌丝阶段,sawC基因的时空表达特征与天蓝色链霉菌whiA的表达特征也一致;而在进化上圈卷产色链霉菌和天蓝色链霉菌亲缘关系较远,表明天蓝色链霉菌中揭示的whiA参与的孢子形成机制可能在链霉菌中具有普遍性。我们进一步的对SawC的结构进行了预测,结果显示SawC与超高温古生菌.强烈炽热球菌中的归巢核酸内切酶PI-Pful可能具有相似的折叠方式,推测SawC可能在同源重组Holliday junctions的解离中发挥作用。
本实验室前期工作克隆到一个DNA片段,包含一个4-羟基苯丙酮酸双加氧酶编码基因(hppD)和一个AsnC/Lrp家族转录调控因子编码基因(asnC)。hppD和asnC在基因组上紧密相邻且转录方向相反。与野生株相比,hppD突变株在酪氨酸为唯一氮源的基本培养基上生长十分微弱,asnC突变株也具有相似的表型;它们相应的互补株都恢复了野生株表型。说明在圈卷产色链霉菌中,hppD、asnC是参与酪氨酸分解代谢过程的关键基因。RT-PCR表明hppD的表达受酪氨酸诱导,并且依赖于AsnC。
san日和sanI是圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因簇中紧邻的两个基因,分别编码细胞色素P450和铁氧还蛋白。推测它们可能参与尼可霉素合成中间体的羟基化。sanH阻断突变株不能产生尼可霉素X和Z,而只积累尼可霉素Lx。尼可霉素Lx是尼可霉素X的类似物,只是在吡啶环上缺少一个羟基。sanI阻断突变株中尼可霉素Lx显著积累同时仍有尼可霉素X、Z的产生。sanH和sanI双基因删除突变株尼可霉素产生情况与sanH单阻断突变株一致。结果表明:SanH和SanI共同负责尼可霉素肽基部分吡啶环上羟基化过程;其中SanH对羟基化是必需的,而SanI能有效促进羟基化但不是羟基化所必需,推测基因组上其它铁氧还蛋白编码基因能够部分替代sanI的功能。
第二部分研究内容为:多氧霉素生物合成基因簇的克隆。多氧霉素与尼可霉素结构相似,同属于核苷肽类抗真菌抗生素。根据尼可霉素生物合成基因信息,作者通过简并引物PCR的方法从可可链霉菌中克隆了多氧霉素生物合成相关基因片断,进而克隆了整个基因簇。作者对基因簇中的一个基因polA(sanX的同源基因)进行了单交换基因破坏,破坏株丧失了多氧霉素的产生能力。进一步利用链霉菌整合型质粒做为载体,构建了多氧霉素基因簇的异源表达质粒并在S。lividens TK24中获得了成功的异源表达。以上实验结果证明作者克隆到了完整的多氧霉素生物合成基因簇。通过与尼可霉素生物合成基因簇的比较,本文对多氧霉素生物合成基因簇中相关基因的功能及在合成途径中的作用做了预测和分析,并提出了一个可能的多氧霉素生物合成途径。