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帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种发生于中老年期的,缓慢进展的神经系统退行性疾病,主要病理改变为中脑黑质致密部（substantia nigrapars compacta,SNc）多巴胺（dopamine,DA）能神经元变性死亡,导致纹状体来自黑质的DA能神经末梢减少,从而引起震颤、肌肉僵直、运动迟缓与体位不稳等一系列综合病症（Lotharius and Brundin,2002）。PD是继阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）之后第二大常见的神经系统退行性疾病,随着人口平均寿命延长和老龄化出现,PD的发病率呈现明显的上升势头。药物治疗以及脑深部电极（deep-brain stimulation,DBS）埋藏治疗可在一定程度上缓解患者的症状,但都存在一些副作用,而且不能从根本上抑制脑内DA能神经元的持续性死亡。近年来神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的研究为细胞替代疗法治疗PD提供了潜在的应用前景,通过移植神经干细胞不但可以来替代部分丢失的的DA能神经元的功能,而且可以通过移植具有分泌神经营养因子特性的细胞抑制DA能神经元的丢失,长期有效地改善患者的症状。在本研究的第一部分,我们利用本实验室建立的胚胎大鼠NSCs的取材和培养方法,分离E14 SD大鼠胚胎前脑室下带区（subventricular zone,SVZ）神经组织,在含有多种神经营养因子的无血清培养基中悬浮培养,经传代后培养出大量NSCs标记分子——神经巢蛋白（neuro epithelial stem cell protein,Nestin）阳性克隆球团。经免疫组织化学方法检测,这些阳性细胞克隆球团经诱导分化后可以分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞,此结果说明本实验取自E14 SD大鼠SVZ区域的细胞具有自我增殖和多潜能分化特性。为长期跟踪移植细胞在体内存活、生长、迁移及分化的过程,我们运用用携带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的重组腺相关病毒（rAAV2-EGFP）在体外培养条件下感染NSCs,通过病毒在细胞内表达EGFP使细胞带有绿色荧光标记。实验中发现,被AAV2-EGFP感染后的NSCs仍具有持续的分裂增殖能力。EGFP标记的NSCs体外诱导分化后,整个细胞从胞体到突起末梢都带有绿色荧光标记,较好显示出了细胞的完整形态,经测定,体外EGFP标记率为65%。在第一部分研究,我们成功建立了NSCs的分离、培养、鉴定和EGFP标记示踪的方法。PD在动物中没有自发倾向,进行PD实验研究需要建立适当的动物模型（陈生弟,陈先文,2003）。建立稳定的能模拟人类PD病理学和行为学改变的动物模型,对PD的发病机制和治疗等方面的研究具有重要的意义。PD大鼠模型由于可直接观察行为学改变、经济和易于操作等原因,成为目前应用最广的研究模型。现在PD模型的制作方法较为成熟,常用的是6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）损毁模型。在第二部分实验中,我们采用了单点内侧前脑束（medialforebrain bundle,MFB）注射6-OHDA方法制备一侧黑质损毁PD动物模型。共制备模型105只SD大鼠（Sprague Dawley,SD）。建模4周后经阿朴吗啡（apomorphine,APO）诱发旋转,旋转7 r/min以上者为成功模型,共有57只,行为学检测造模成功率为54%。模型动物造模成功后分别在30,60和120天后再次进行行为学检测以跟踪动物的自我恢复可能性,统计结果显示与造模成功后的初次检测结果无显著性差异（P＞0.05）,表明PD模型稳定,没有自我修复现象。对PD模型组动物中脑黑质酪氨酸羟化酶（tyrosion hydrozylase,TH）免疫组织化学检测发现,成功PD大鼠中脑黑质正常侧TH反应阳性神经元数量较多,胞体较大,突起明显;而6-OHDA损毁侧TH阳性神经元数量则明显减少,细胞丢失超过90%以上。120天后PD模型动物损伤侧神经元数量减少仍然在90%以上,从组织学上证明模型的稳定。我们对成功的PD模型大鼠和正常大鼠分别在黑质或纹状体移植rAAV2-EGFP标记的NSCs,移植后30、60和120天进行行为学检测。结果表明,NSCs移植到PD大鼠黑质或者纹状体,随着移植细胞在宿主脑内存活时间的延长,动物的行为学症状得到显著改善（P＜0.05,P＜0.01）。在NSCs移植疗法中,NSCs作为一种外源性物质能否在损伤的黑质区域存活或者迁移,能否向黑质特定DA能神经元分化是细胞移植治疗PD疗效的关键。在第三部分实验中我们研究了移植细胞的行为变化。在细胞移植后30、60和120天不同时期取脑进行连续切片,在移植后不同时间的脑片上我们均发现了大量EGFP标记的细胞,说明EGFP作为示踪记在细胞移植后仍然长期稳定表达,外源性的NSCs可以通过异体移植在宿主内长期存活。对各时间段有移植细胞标记的脑片进行免疫组化检测,结果显示移植的细胞可以分化为多种神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞。通过EGFP的示踪显示,移植细胞具有迁移现象并存在一定规律。移植到黑质的细胞随着时间的延长,在黑质区迁移的距离也越远,但总体上移植细胞是在受损的黑质区域内迁移,只有少量的细胞迁移到黑质区域以外。移植到纹状体的细胞呈条索状排列从移植位点向腹后内侧黑质部位进行较为广泛的长距离迁移,迁移具有明显的方向性并在黑质致密部可见散在移植细胞。实验结果提示移植的NSCs可以在体内存活并有迁移和分化能力,CNS损伤区微环境对移植细胞的迁移和分化具有一定诱导作用。综上所述,我们得出以下结论:1,从E14天胚胎大鼠SVZ分离出来的神经细胞群,能不断的更新和增殖,具有良好的可传代性,体外培养可以诱导分化为神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞等多种类型,具有自我增殖和多潜能分化的干细胞特性。利用rAAV2-EGFP感染NSCs,可以使NSCs带有稳定绿色荧光标记,标记后NSCs仍具有增殖和分化特性。成功建立了胚胎大鼠NSCs的培养、鉴定和EGFP示踪标记方法。2,单点MFB注射6-OHDA制备一侧黑质损毁PD动物模型,应用免疫组化和行为学检测证明模型制作成功、可靠并可以长期保持稳定。用体外培养的rAAV2-EGFP标记的NSCs移植PD模型大鼠纹状体或者黑质,随着移植细胞在宿主脑内存活时间的延长,可以明显改善PD动物行为学症状。3,跟踪NSCs移植后不同时间段移植细胞的分化和迁移特性。移植细胞在宿主脑内分化为多种神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞。移植细胞具有迁移现象并存在一定规律。移植到黑质的细胞总体上在受损的黑质区域内迁移;移植到纹状体的细胞呈条索状排列从移植位点向腹后内侧黑质部位进行较为广泛的长距离迁移,具有明显的方向性并在黑质致密部可见散在移植细胞。提示CNS损伤区微环境对移植细胞的迁移和分化具有一定诱导作用。