第一部分：人微血管内皮细胞的分离、纯化、培养和鉴定 目的：建立人皮肤微血管内皮细胞的分离、纯化、培养和鉴定技术，为进一步建立三维血管新生体外模型奠定基础。 方法：1，取人包皮组织，Dispase消化后分离细胞，EGM培养；2，用CD31-Dynabeads免疫磁珠吸附法纯化内皮细胞；3，用Ⅷ-因子相关抗原免疫组化进行纯度鉴定。 结果：原代分离的内皮细胞中含有大量的成纤维细胞污染，经CD31-Dynabeads纯化两次后，内皮细胞的纯度经Ⅷ-因子相关抗原免疫组化鉴定可几乎达100％。内皮细胞单层培养时呈典型的“铺路石”样，并具有成血管特性。内皮细胞的分离、纯化和培养技术的关键是：1，选择合适的培养液；2，纯化过程中把握好内皮细胞的消化程度；3，在细胞培养过程中要尽量避免培养条件的剧烈变化。 结论：成功建立了人皮肤微血管内皮细胞的分离、纯化、培养及鉴定技术。获取的内皮细胞纯度几乎达到100％，可进一步用于血管新生体外模型的构建及相关研究。 第二部分：基于微载体和纤维蛋白基质的血管新生三维模型构建及bFGF和VEGF的体外促血管新生协同作用 目的：建立基于人微血管内皮细胞(HMVECs)、微载体和纤维蛋白基质的体外三维血管新生模型，并定量观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的体外促血管新生作用及其协同效应。 方法：1，从人包皮组织中分离、纯化培养人微血管内皮细胞；2，将内皮细胞包被于微载体(Cytodex-3)；3，将包被有内皮细胞的微载体包埋于由培养液配制的三维纤维蛋白基质凝胶中(1.0mg/mL)，并在培养体系中添加不同浓度的生长因子bFGF和(或)VEGF。实验在24孔培养板中进行，分为三组：bFGF组、VEGF组和bFGF+VEGF组。bFGF及VEGF设0ng/mL(对照)，10ng/mL，20ng/mL，30ng/mL及40ng/mL五个浓度剃度。连续培养72小时，于24、48及72小时随机照相，通过测量每个微载体上毛细血管样结构的平均长度(ALS)，定量分析bFGF及VEGF的体外促血管新生作用及其协同效应。 结果：在bFGF和VEGF的作用下，包被在微载体上的内皮细胞侵入三维纤维蛋白基质，形成“出芽”(sprouts)状结构，后者不断延长，形成具有内腔的类似毛细血管样的结构。bFGF和VEGF都以剂量依赖性方式发挥促血管新生效应。在24小时，10ng/mLbFGF组和10ng/mLVEGF组的ALS分别为32.13±16.6μm和43.75±27.92μm，和对照组(5.88±4.45μm)比较有显著性差异(P＜0.01)，随着时间的延长，这种差异更为显著。bFGF10ng/mL+VEGF10ng/mL的作用大于bFGF10ng/mL和VEGF10ng/mL单独作用的和，也大于bFGF20ng/mL或VEGF20ng/mL的单独作用，线性模型分析说明bFGF和VEGF在体外具有促血管新生协同作用。 结论：1，本研究成功构建了一种基于微载体的血管新生体外三维模型。该模型能很好地模拟体内血管新生的特征性过程，可用于对血管新生活性物质的定量研究。2，bFGF和VEGF都以剂量依赖性方式发挥促血管新生作用，且具有协同效应。 第三部分：人重组bFGF的克隆、酵母表达及其生物学活性检测 目的：1，构建碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的酵母(S.Cerevisiae)真核表达体系，以获取可用于研究的重组人bFGF；2，应用MTT及自行构建的血管新生体外三维模型检测酵母表达的重组人bFGF的体外活性，从而进一步验证这种体外模型在血管新生活性物质评价中的价值。方法：应用基因重组技术，将自人肝脏cDNA文库获得的bFGF序列连接到克隆载体pBluescriptⅡSK(+)，经Top10大肠杆菌克隆后再连接到表达载体pEG(KT)。构建的重组质粒(pEG(KT)-bFGF)转化酵母菌株BCY123，半乳糖诱导表达12小时后收集细胞，用GlutathioneBeads纯化GST-bFGF融合蛋白，并做Thrombin酶切，最终获得纯化的人重组人bFGF。纯化产物经SDS-PAGE电泳及NorthernBlot鉴定后，采用MTT及自行构建的体外血管新生三维模型检测其促内皮细胞增殖和促血管新生活性。 结果：1，转化有pEG(KT)-bFGF载体的酵母菌BCY123在半乳糖诱导下表达可溶性GST-bFGF融合蛋白。细胞裂解液经GlutathioneBeads纯化及Thrombin酶切后获得了高纯度重组人bFGF。SDS-PAGE电泳和NorthernBlot证实，获取的产物为18kDa的bFGF。2，酵母表达的bFGF的促人微血管内皮细胞增殖活性与商品化等剂量的大肠杆菌表达的bFGF无明显统计学差异(P＞0.05)。3，酵母表达的bFGF的体外促血管新生活性与商品化等剂量的大肠杆菌表达的bFGF无明显统计学差异(P＞0.05)。 结论：1，通过基因重组技术可在酵母中表达具有生物活性的人bFGF。2，本课题构建的体外三维血管新生模型可用于定量检测血管新生活性物质的生物活性。 第四部分：三维血管新生模型中内皮细胞基因表达变化的芯片分析 目的：采用Affymetrix基因芯片分析基于微载体的三维血管新生中微血管内皮细胞的基因表达变化。方法：首先建立基于微载体的三维血管新生体外模型。在该模型中，包被于微载体的人皮肤微血管内皮细胞侵入基质，形成类似“出芽”的结构，“出芽”状结构不断延长、分枝，并相互联接，最终在纤维蛋白基质中形成类似毛细血管的网络样结构。然后在模型生长的不同时间点(0.5h、24h和72h)提取内皮细胞的总RNA，采用Affymetrix芯片进行基因表达的比较，基因芯片的原始资料采用厂家提供的软件进行分析，部分基因的表达谱经半定量PCR验证。被调节的基因根据其功能和表达变化方式进行分类。鉴于基因芯片结果十分丰富，本文仅对其中趋化因子和趋化因子受体的表达进行详细描述和分析。 结果：在本研究基于微载体的三维血管新生模型中，有1,961个基因表达的变化在2倍以上(上调或下调)，其中468个基因的表达变化在3倍以上。采用厂家网站提供的工具(GeneOntologyMiningTool)分析，这些基因可归为生长因子或其受体、细胞增殖调节因子、细胞周期相关分子、信号分子或转录因子等等。基因表达的变化方式可分为六类。芯片检测到的趋化因子和趋化因子受体有CXCL1/GRO-α、CXCL2/GRO-β、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP2、IL-8/CXCL8、CXCL12/SDF-1、CXCL9/Mig、CXC11/ITAC、CX3CL1/Fractalkine、CCL2/MCP-1、CCL3、CCL5/RANTES、CCL7、CCL15、CCL21、CCL23、CCL28，以及CCR1、CCR9、CXCR4等。在体外血管新生中，这些基因的表达呈现不同的变化方式，提示他们在血管新生的不同阶段具有特别作用。其中，CCL2/MCP-1、CCL5/RANTES和CX3CL1/Fractalkine在“出芽”期(24小时)特异性上调，提示这三种趋化因子在血管新生的早期可能具有关键性作用。 结论：基于我们构建的血管新生模型，本研究采用基因芯片技术从整个基因组水平动态观察了人微血管内皮细胞在体外血管新生过程中基因表达的变化。芯片的结果给我们提供了丰富的有关血管新生分子机制方面的信息，并为进一步研究单个基因在血管新生中的作用提示了方向。