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目的 冠状动脉粥样硬化常伴随着患者的高血糖症，患者血管内血糖浓度较高。一般认为，高血糖常抑制内皮细胞增殖，促进内皮细胞凋亡。糖尿病与早期心血管疾病间的关系得到确认，高血糖是内皮功能障碍的主要原因。 目前临床上广泛应用使用的316L不锈钢支架材料含有镍离子，镍离子具有致敏、致癌和诱发血栓等毒副作用。其炎症反应刺激了支架周围血管损伤部位细胞异常，研究认为316L不锈钢中的镍离子释放引起的接触过敏加重了炎症反应，刺激支架周围新生组织的增生，增大了再狭窄的可能性。HNNF(Highnitrogennickelfree，HNNF)新型不锈钢金属是一种去除镍元素添加氮元素的支架材料。 本论文通过结合高血糖环境下血管内皮细胞在不同金属支架材料上的增殖状况，研究HUVEC细胞的细胞形态、细胞生长活性、细胞凋亡、细胞周期和基因表达等方面的影响，比较两种不锈钢金属支架材料在支架再狭窄方面的优劣，为新型支架材料的开发和改良提供实验基础。 实验材料与方法 1、高糖损伤模型的建立: 向含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养液中添加D-(+)-Glucose右旋葡萄糖配制5组梯度浓度的培养基。其葡萄糖含量终浓度分别为10mmol/L，15mmol/L，20mmol/L，25mmol/L，30mmol/L，为高糖组。普通RPMI-1640培养液为对照组。取处于对数生长期HUVEC细胞制成细胞悬液，以1×104/孔的细胞浓度接种于24孔培养板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养。各组均在开始培养后的1、3、5和7天进行CCK-8检测，每组设3个复孔，用酶联免疫检测仪与450nm波长处测定没孔的OD值。求出每组3个孔的平均OD值，然后计算细胞相对增值率(relativegrowthrate，RGR)，RGR=（实验组OD值/对照组OD值×100％）。 2、观察细胞生长状况: 将体外培养的HUVEC细胞制成细胞悬液，接种于各组24孔培养板中，加入30mmol/L高糖培养液，将24孔培养板放入37℃、5％CO2培养箱中分别培养3天和7天，待细胞细胞基本长成单层，取出长有细胞的金属片，用姬姆萨染液进行细胞染色，置于金相显微镜下观察HUVEC细胞的生长状况。从形态上观察高糖环境下316L和0.62N两种不同金属材料对HUVEC细胞生长状况的影响 3、细胞生长活性的测定: 取处于对数生长期的HUVEC细胞，成细胞悬液，接种于各组6孔培养板中，各组均置于37℃、5％CO2培养箱中培养。各组均在开始培养后的1、3、5天取样，通过CCK-8比色法测定细胞的生长活性，用酶联免疫检测仪于450nm波长处测定每孔的OD值，求出每一组的平均OD值。计算细胞的相对增值率(relativegrowthrate，RGP)，对各组结果进行评价。定量分析高糖环境下316L和0.62N两种不锈钢金属支架材料对HUVEC细胞增殖及细胞生长活性的影响。 4、细胞周期分析: 取处于对数生长期的HUVEC细胞，成细胞悬液，接种于各组6孔培养板中，各组均置于37℃、5％CO2培养箱中培养。各组细胞均在开始培养7天后用不含血清的新鲜培养液饥饿培养22h，再更换为含有10％胎牛血清的完全培养液培养24h，在不同时间点分别取样，并收集细胞置于离心管中，通过流式细胞仪进行细胞周期分析。定量分析高糖环境下316L和0.62N两种不锈钢金属支架材料对HUVEC细胞细胞周期的影响。 5、细胞凋亡检测 取处于对数生长期的HUVEC细胞，成细胞悬液，接种于各组6孔培养板中，各组均置于37℃、5％CO2培养箱中培养。各组均在开始培养后的7天取样，并收集细胞置于离心管中通过流式细胞仪对细胞凋亡进行检测，定量分析高糖环境下316L和0.62N两种不同不锈钢金属支架材料对HUVEC细胞凋亡的影响。 6、实时定量PCR检测 取处于对数生长期的HUVEC细胞，制成细胞悬液，接种于各组6孔培养板中，各组均置于37℃、5％CO2培养箱中培养。各组均在开始培养后的7天取样，并收集细胞置于1.5mL离心管中，做好标记。按照TRIzol说明书的要求提取RNA，测定各组RNA纯度和浓度。按照Takara试剂盒说明书的要求，反转录得到DNA模板，并按照要求进行Real-TimePCR的检测。以基因GAPDH作为内参，定量分析高糖环境下316L和0.62N两种不锈钢金属支架材料对HUVEC细胞基因水平表达的影响。 结果 1、在不同糖浓度下对HUVEC细胞通过镜下观察、CCK-8细胞活力测定、SOD测定和MDA测定，30mmol/L浓度下是考察高糖环境下细胞增殖理想浓度。 2、通过镜下观察、CCK-8实验和对高糖环境下细胞增殖活性的检测，及流式细胞仪下细胞周期的检测可以看出培养在0.62N不锈钢金属材料上的HUVEC细胞生长活性低于在316L不锈钢金属材料上培养的HUVEC细胞(P＜0.05)，且均高HUVEC细胞在体外培养的正常水平。 3、通过流式细胞仪对细胞凋亡的检测可以看出培养在316L不锈钢金属材料上的HUVEC细胞培养7天后细胞早期凋亡和晚期凋亡比例高于0.62N不锈钢金属支架才上的HUVEC细胞。 4、通过实时定量PCR检测的结果可以看出培养在316L不锈钢金属材料上的HUVEC细胞凋亡相关的基因caspase3、caspase8和FAS的基因表达水平高于0.62N组(P＜0.05)，而caspase9中的基因表达水平，0.62N组高于316L（P＜0.05）;自噬相关的基因ATG5、ATG7、ATG12中，316L组基因表达量高于0.62N组(P＜0.05);细胞周期相关基因cyclinE和cyclinA中，0.62N组基因表达量高于316L组。 结论 1、通过细胞形态的观察、细胞生长活性、细胞周期和细胞凋亡以及实时定量PCR的检测结果，发现0.62N不锈钢金属材料具有促进血管内皮细胞增殖的作用。 2、与316L不锈钢金属支架材料相比，0.62N在成分上去除了镍元素对细胞的潜在毒性作用，可能是其相较于316L不锈钢金属支架材料具有促进血管内皮细胞增殖的作用的原因。