鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)高发于我国南方，是一种恶性程度较高的肿瘤，其发病与遗传因素、EB病毒以及环境和饮食等多种因素有关。瘤基因的活化和抑瘤基因的失活是肿瘤发生发展的重要的分子机制之一。在鼻咽癌中，对许多的抑瘤基因研究后发现，一些常见的抑瘤基因，如p53、Rb、P21、P16、VHL和FHIT等，很少甚至不发生突变，这提示可能还有一些没被发现的鼻咽癌相关抑瘤基因存在，以及在鼻咽癌中抑瘤基因还有除突变以外的其他失活机制。因此，寻找鼻咽癌相关候选抑瘤基因及探讨其失活的分子机制，将有利于进一步了解鼻咽癌变的机理，对鼻咽癌临床诊断及治疗也将起到重要的作用。 一 从差异表达谱芯片中筛选的基因的研究 基因芯片为分析肿瘤发生发展相关基因及表达程度提供了强有力的工具。高密度cDNA表达阵列已成功应用于人类多种疾病的基因表达的研究中，并获得了相应表达谱及发现了许多新的与疾病相关的基因。在鼻咽癌中，也通过基因芯片技术筛选出了很多差异表达基因，但是还需通过进一步实验验证这些基因与鼻咽癌的关系及其在鼻咽癌中的作用。我们以本实验室的四张鼻咽癌芯片的结果为原始数据，结合通过检索PUBMED和CNKI数据库得到的其他肿瘤中表达谱芯片的结果，选取了ANXAI和 LTF 两个基因作为本实验的研究对象。首先我们通过RT-PCR方法检测了基因mRNA的表达水平，然后从遗传学和表遗传学两个方面分析了基因在鼻咽癌中失活的机制。实验包括以下五个部分： 1.鼻咽癌组织中ANXAI和 LTF表达的验证 为了验证ANXAI和LTF基因在鼻咽癌中的mRNA表达水平，我们用半定量RT-PCR检测了33例鼻咽癌组织和15例慢性鼻咽炎组织中ANXAI和LTF mRNA的表达水平，发现ANXAJI基因在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中都稳定表达，没有mRNA表达水平的差异；LTF基因在慢性鼻咽炎组织中恒定表达，在鼻咽癌组织中却表达明显缺失或下调，达到76％。而且LTF 基因在鼻咽癌组织中的表达与患者的性别无关(P>0.05)，但与颈部淋巴结转移有相关性(P<0.05)，在有颈部淋巴结转移的患者中基因的mRNA表达水平明显低于没有颈部淋巴结转移的患者。 2鼻咽癌组织中LTF微卫星位点杂合性丢失 PCR方法检测了20例鼻咽癌组织及其配对外周血中微卫星位点D3S4169和GDB:181215杂合性缺失情况，结果发现两个位点的丢失率分别为10％(2／20)和20％(4／20)。其中有1例鼻咽癌标本同时有这两个位点的丢失，因此，LTF 总的丢失率为25％。这提示微卫星位点的杂合性丢失可能对 LTF 在鼻咽癌组织中表达下调起了一定的作用。 3 LTF基因突变的研究 通过：PCR-SSCP方法和测序分析了LTF基因启动子区、第1外显子和第2外显子的突变情况。在15例鼻咽癌组织中我们检测到了启动子区在1例鼻咽癌组织中有突变，即启动子区的1056delC；第2外显子在4例鼻咽癌组织中有突变，其中3例在同一位点出现了突变，即5386G>A，导致编码的氨基酸由丙氨酸>苏氨酸，另外1例突变则为5396C>T，三联体密码由CAA>TAA，CAA编码谷氨酸，而TAA为终止密码。根据我们的分析可以得出，LTF在鼻咽癌组织中的突变率为33.3％(5／15)，而且所检测到的突变可能都具有一定的意义：启动子区的突变可能会影响其与反式作用因子的结合，从而导致mRNA的转录失活；而第2外显子的突变为错义突变和无义突变，也有可能导致转录的失活。因此，LTF基因的突变可能是其在鼻咽癌中转录失活的分子机制之一。 4鼻咽癌组织中LTF启动子区甲基化状态 为了探讨LTF基因启动子区甲基化与鼻咽癌的关系，采用甲基化特异性PCR方法检测了33例鼻咽癌组织和15例慢性鼻咽炎组织中LTF启动子区CpG岛甲基化情况，结果显示15例慢性鼻咽炎组织中无1例发生甲基化，而在鼻咽癌组织中有21例(63.6％)有高甲基化。鼻咽癌组织与慢性鼻咽炎组织相比，两者发生LTF启动子区高甲基化的几率存在明显的统计学差异(p=0.000)；通过分析我们还发现LTF启动子区CpG岛甲基化与颈部淋巴结转移之间存在相关性(p=0.016)。在12例LTFmRNA表达异常的标本中，有83.3[％](10/12)发生了启动子区的高甲基化。这些结果说明LTF基因表达失活与其启动子区高甲基化有一定的关联，很可能是鼻咽癌发生发展的原因之5DNA去甲基化对鼻咽癌细胞株5-8F和6-10BLTF基因mRNA表达的影响 为了证实LTF启动子区高甲基化与LTF表达是否存在确切的关系，我们用甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷处理鼻咽癌细胞株5-8F和6-10B，通过RT-PCR和甲基化特异性PCR分别检测了处理前和用不同浓度的药物处理细胞后的甲基化和mRNA表达水平情况。结果提示：高甲基化能明显抑制鼻咽癌细胞株5-8F和6-10B中LTF基因的mRNA表达，而去甲基化后能重新激活或增强该基因的表达。进一步表明LTF基因启动子区高甲基化能影响其mRNA表达水平。二染色体3p21.3区基因在鼻咽癌中的研究 最近，比较基因组杂交和微卫星多态性位点全基因组扫描的研究结果提示，鼻咽癌患者在3p最常发生连续性、非随机性杂合性丢失(10SS of heterozygosity，LOH)，其中3p14-21、3p21.3-22和3p25-26是原发性鼻咽癌LOH的高发频率区。进一步通过微细胞融合单染色体转移技术的功能性研究将与鼻咽癌发生密切相关的抑瘤基因定位于3p21.3(D3S1568)为中心的D3S1298-D3S1578之间，长度约为11.2cM的区域内。与此同时，大量的研究也证实人类常见的恶性肿瘤如肾癌、肺癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌和乳腺癌等也常常发生3p21-22的LOH，甚至发生纯合性丢失。最近，Lerman等研究证实在肺癌细胞系中染色体3p21.3存在一个630kb的缺失区域，有25个候选的抑瘤基因位于其中。由于Cheng等在鼻咽癌细胞株HONEl中发现的11.2cM的抑瘤片段正好覆盖了在肺癌发现的最小共同缺失区域(MDRs)，因此这些肺癌中的候选抑瘤基因可能在鼻咽癌发生发展中起了一定的作用。为了揭示3p21-3区这些候选抑瘤基因在鼻咽癌中的意义，我们选择了SEMA3B、SEMA3F、FUSl和GNAT1基因进行研究，期望能从中寻找与鼻咽癌发生、发展有关的候选抑瘤基因。 1 鼻咽癌组织中基因tuRNA表达水平的检测采用：RT-PCR 方法检测了33例鼻咽癌组织和15例慢性鼻咽炎组织中基因的表达情况。结果发现，在鼻咽癌组织中，SEMA3B和GNATl的表达异常分别为75.8％(25／33)和72.7％(24／33)，而SEMA3F和FUSl在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织全部稳定表达，没有明显差异。SEMA3B和GNATl在鼻咽癌和慢性鼻咽炎组织中的表达存在显著统计学差异(p<0.05)，但两者在鼻咽癌中的表达与患者的性别和颈部淋巴结转移无相关性(p>0.05)。 2 鼻咽癌组织中基因微卫星位点LOH分析 通过PCR方法检测了20例鼻咽癌组织微卫星位点的LOH情况。结果发现9例鼻咽癌组织有SEMA3B微卫星位点的LOH，丢失率为45％；而GNATl LOH为15％(3／20)。SEMA3B和GNATl的LOH与其表达存在相关性(p<0.05)。结果提示LOH可能是SEMA3B和GNATl在鼻咽癌中失活的分子机制之一。 3 鼻咽癌组织中SEMA3B和GNATl启动子区甲基化状态 用甲基化特异性PCR方法进行了SEMA3B和GNATl启动子CpG岛甲基化的检测，结果发现100％(33／33)的鼻咽癌组织存在SEMA3B和GNATl启动子CpG岛的高甲基化；而在慢性鼻咽炎组织中也分别有73.3％(11／15)和80％(12／15)的SEMA3B和GNATl启动子CpG岛存在甲基化。表明SEMA3B和GNATl基因启动子区甲基化与它们在鼻咽癌组织中的表达缺失或下调无明显因果关系，SEMA3B和GNATl基因启动子区高甲基化可能并不是鼻咽癌发生发展的特异性标记。 综上所述：通过分析，我们找出了LTF、SEMA3B和GNATl三个鼻咽癌相关候选抑瘤基因，并初步分析了它们在鼻咽癌中失活的可能机制。结果提示，LTF基因在鼻咽癌组织中表达下调或缺失，微卫星位点杂合性丢失、突变和启动子区甲基化对其失活都起了一定的作用，但根据我们的研究结果，认为启动子区甲基化是其失活的主要机制。SEMA3B和GNA开基因在鼻咽癌组织中表达下调或缺失，其原因部分归因于微卫星位点的杂合性丢失。