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研究背景与目的炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC),其在西方国家较为常见,在我国的发病率也逐年上升。UC的病因与发病机制不完全清楚,涉及基因、环境、免疫和微生物因素等。UC患者存在显著的肠道菌群组成改变,其中普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii,F.prausnitzii)和人罗斯拜瑞氏菌含量显著下降为其主要特征。已有研究证实肠道菌群中的F.prausnitzii可以通过多种途径缓解肠道炎症反应,且F.prausnitzii是UC患者重要的干预靶点。而作为肠道中识别微生物的重要免疫防线,肠腔内免疫球蛋白A(ImmunoglobulinA,IgA)已经被证实可以介导免疫-菌群互作,从而对菌群结构进行调节。随着流式分选及高通量测序的发展,研究者发现UC患者肠道中IgA包裹的F.prausnitzii含量升高。然而UC患者中F.prausnitzii含量下降是否由IgA升高引起尚无人研究。因此我们开展临床及动物实验,说明溃疡性结肠炎患者中IgA识别F.prausnitzii致其在肠道定植下降,并挖掘特定抗原识别蛋白,探讨针对该蛋白的IgA免疫反应参与肠道菌群紊乱和黏膜炎症过程,为UC的临床治疗提供了新的理论基础。研究方法:1.临床样本收集:纳入诊断明确的UC患者和健康对照者,签署书面知情同意书后,收集粪便样本,并进行16S rRNA测序,同时采集患者基本信息及临床检验信息。2.临床样本粪便IgA检测:溶解并稀释粪便上清后,进行ELISA实验检测粪便上清中总IgA及F.prausnitzii特异性IgA含量,进行Western Blot识别F.prausnitzii.与IgA结合的特异性位点。3.抗原鉴定与验证:将电泳后的F.prausnitzii蛋白进行考马斯亮蓝染色,切取与Western Blot条带位置一致的蛋白送检,经过鉴定及筛选,我们选定丙酮酸铁氧蛋白还原酶[pyruvate:ferredoxin(flavodoxin)oxidoreductase,PFOR]为目标抗原,经过进一步的克隆表达并纯化出PFOR蛋白。进一步通过ELISA实验,检测PFOR特异性IgA含量,运用Taxfun4预测粪便中含PFOR基因细菌的含量。4.PFOR刺激PBMCs实验:提取人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)进行培养,加入纯化后的PFOR蛋白及硝唑尼特(Nitazoxanide,NTZ)进行刺激,进行实时荧光定量PCR实验检测Il1b、Il6、Il117a、Tnfa、Ifnr炎症因子表达,并进行IFN-γELISpot评估抗原特异性T细胞反应。5.构建F.prausnitzii致敏模型:将新西兰大耳白兔分为PBS对照组,QuilA致敏组,QuilA+FP致敏组,于第一天进行颈部皮下注射,每日称量体重并收集粪便样本,进行各肠段H&E染色评估上皮完整性及炎症细胞浸润,进行16S rRNA测序分析菌群改变,进行ELISA评估粪便上清中总IgA及F.prausnitzii、PFOR特异性IgA含量,进行PCR检测pIgR、Ifnr、Il6、Il1b、Il22、Cox2等炎症因子表达。6.构建PFOR致敏模型:将新西兰大耳白兔分为QuilA致敏组及QuilA+PFOR致敏组,于第一天进行颈部皮下注射。记录体重并检测组织炎症程度,肠道菌群改变,IgA含量及组织mRNA表达。7.PFOR相关微生物挖掘:挖掘肠道菌群中其余含PFOR基因的细菌,比较PFOR氨基酸序列相似性,分析同源性并构建系统进化树,检测含PFOR基因的细菌的丰富度。研究结果:1.UC患者较健康志愿者肠道菌群α-多样性显著下降,个体间差异变大,且F.prausnitzii含量显著减少。ROC曲线表示使用F.prausnitzii含量进行UC的诊断具有较高的特异性。2.UC患者粪便上清中总IgA及抗F.prausnitzii特异性IgA显著升高,Western Blot结果显示在130kDa及85kDa处见明显条带。经鉴定丙酮酸铁氧蛋白还原酶(PFOR)为目标抗原。我们进一步发现UC患者中PFOR特异性IgA含量明显升高且粪便菌群中PFOR基因含量下降。3.PFOR促进PBMC中IFN-γ表达,NTZ可以抑制PFOR对IFN-γ表达的促进作用。4.F.prausnitzii免疫导致新西兰大耳白兔体重一过性下降及盲肠、回肠组织炎症;粪便上清总IgA、F.prausnitzii特异性IgA及PFOR特异性IgA升高;QuilA及QuilA+FP组回肠组织Ifnr均升高,QuilA组结肠组织Ifnr表达升高;同时F.spraunitzii免疫后肠道菌群结构改变及粪便含PFOR基因细菌丰富度下降。5.PFOR免疫组体重一过性下降后出现升高,且较QuilA组体重更高。组织炎症评分上未见组间差异,但PFOR免疫组各肠段Ifnr表达均升高。粪便上清IgA水平上均无统计学差异,但PFOR免疫引起了肠道菌群结构的改变,并导致粪便中含PFOR基因细菌丰富度下降。6.我们分析了 5种代表性的含PFOR基因的细菌,其PFOR氨基酸序列一致性高,同源性高,进化上相对保守。进一步分析发现,UC患者肠道菌群中Blautia wexlerae丰富度较健康对照者显著降低,Fusobacterium nucleatum丰富度显著升高,而Bacteroides sp.AR29,Escherichia coli丰富度无明显差异。研究结论:1.UC患者肠道菌群多样性下降,F.prausnitzii丰富度减少,且粪便上清总IgA、F.prausnitzii特异性IgA和PFOR特异性IgA含量升高。2.PFOR作为F.prausnitzii的抗原,在多种细菌中存在,氨基酸序列相似性高,进化上相对保守,可引起外周血单个核细胞分泌IFN-γ。3.动物实验表明,F.prausnitzii、PFOR致敏可导致新西兰大耳白兔体重变化,组织黏膜炎症,组织Ifnr表达升高及菌群结构改变,尤其是粪便中PFOR基因下降。