卵巢癌(ovarian cancer)是严重危害妇女健康的三大癌症之一,发生率居妇科恶性肿瘤的第三位,其较高的转移和复发率决定了卵巢癌有着很高的死亡率,探索和发现卵巢癌的生物标记物对于卵巢癌的早期筛查、诊断、化疗及预后等方面有重要意义。miRNAs,是一类小分子未编码的RNA,在各式各样的人类肿瘤中,通过抑制基因表达或降解mRNA以及抑制蛋白质的合成和功能来发挥抑癌或促进癌症的作用。miRNAs在人类癌症中的意义近年来也引起国内外学者的广泛关注,在过去的十多年里,microRNA在人类癌症中已被广泛研究,他不仅可以作为癌基因也可作为抑癌基因参与肿瘤的发生和发展。MicroRNA可以用于早期癌症检测和干预癌症治疗,但是有关miRNAs在人卵巢癌分子机制水平上的探索尚少。有报道指出,miR-203在肺癌、前列腺癌和乳腺癌中作为一个抑癌基因发挥抑癌作用,抑制肿瘤细胞的增殖和转移。然而miR-203在卵巢癌中的作用仍不十分清楚,因此,我们设想在卵巢癌中miR-203也参与癌症的发生发展过程,本研究中我们试图分析miR-203在卵巢癌中的作用以及其分子生物学机制,为卵巢癌的诊断、治疗和预后寻求新的靶点。瘦素是OB,脂肪因子。是1个16个氨基酸残基,146KDa的蛋白质的一种类激素。基因表达瘦素,在机体内发挥多种功能,在人体中参与肿瘤发生。生物学功能方面,卵巢组织中有微量表达。卵巢癌组织瘦素表达上调。但是目前在卵巢癌中,瘦素的生物学功能和作用机制鲜有报道。因此本研究中我们设想在卵巢癌病人的血清、尿液与肿瘤组织中瘦素的表达同样升高。目的1.体外实验研究mir-203对卵巢癌细胞的影响,分析过表达mir-203及沉默其目标基因的表达后在卵巢癌中发挥的作用,为卵巢癌的诊断和治疗奠定基础。2.动物实验,通过对小鼠病理标本中mir-203的表达研究mir-203的体内效应,探索其作为卵巢癌诊断指标的可行性。3.对卵巢癌患者的病理组织内mir-203的表达进行分析,以期发现mir-203在卵巢癌的临床筛查,早期诊断,治疗及预后等方面的生物标记潜能。4.通过对卵巢癌患者血清,尿液以及肿瘤组织中瘦素的表达水平分析其在卵巢癌中发挥的功能,探索瘦素作为临床诊断卵巢癌生物标记物的可能性。材料和方法1.研究对象:细胞株:skov3和ovcar3细胞系均来自美国菌种保存中心。病例:20例人卵巢癌标本和20例正常卵巢癌组织来自美国田纳西州孟菲斯西南癌症医院,来自郑州大学第一附属医院和第三附属医院的手术标本60例.2.研究方法:(1)蛋白印迹法检测mir-203过表达后的emt标记蛋白的表达情况以及临床标本中瘦素的表达:将导入空载体和mir-203的skov3和ovcar3细胞培养至80%密度,收集细胞,洗涤,裂解细胞膜并收取蛋白,采用蛋白印迹法检测细胞e-cadherin,vimentin和snial2的表达水平,以gapdh为内参对照。同样的方法检测卵巢肿瘤组织中瘦素蛋白的表达水平。(2)mtt和细胞克隆集落形成实验研究细胞生长增殖速度mtt:在96孔板上,种植2000个细胞每孔。分别培养24,48,72和96小时后,每孔加入10μl的mtt反应剂,培养4个小时。然后轻轻倒出加了mtt的培养液,每孔加入200微升的细胞冻存液,摇床震荡10分钟,避光。利用多功能酶标仪在570nm波长处测定其吸光度。细胞集落实验:实验组和对照组细胞按每孔300个细胞接种于6孔板上,每5天换液一次,2周后用结晶紫固定染色,分析比较两组细胞克隆集落大小及数目。(4)细胞迁移能力分析1x104个卵巢癌细胞用不含血清的培养,细胞种在小室上,下室dmem培养液加入含fbs的dmem,培养5个小时。用棉签拭去小室上层细胞,甲醇固定15分钟,再用结晶紫染色30分钟,最后荧光显微镜下照相,比较两组细胞的迁移能力。(5)细胞侵袭能力分析1x105个卵巢癌细胞种在覆盖有基底膜的小室上,用不含fbs的dmem培养,下室为有血清的营养液,连续培养24小时之后,拭去上小室的细胞,甲醇固定15分钟,紧接着结晶紫染色30分钟,用棉签擦掉小室上层细胞,照相,计数。比较两组细胞的invasion能力。(6)caspase3/7检测药物诱导的空载体转染和mir203过表达后skov3、ovcar3两种细胞系的细胞凋亡capases3/7细胞凋亡:三孔重复,准备好测量荧光强度的测量系统和反应试剂盒。在96孔板上,种上8000个卵巢癌细胞,培养过夜,接着在无血清的条件下,血清饥饿一个小时。用不同浓度的化疗药物处理细胞,继续37度连续培养细胞24个小时,最后用caspase3/7检测,24小时后细胞的凋亡。(7)动物实验:选用3~4周左右的雌性nsg小鼠10只并检测健康状况,注射细胞,建立模型。5×106skov3和mir203过表达的skov3、ovcar3细胞系小鼠皮下注射,每天检查,每组5只。持续8周。两个月后,处死小鼠,测量肿瘤数量及重量。(8)免疫荧光法检测卵巢癌患者癌组织中snial2和e-cadherin,vimentin的表达情况:收集卵巢癌和正常卵巢组织,制作石蜡组织切片,对snial2、e-cadherin和vimentin进行免疫荧光染色,荧光显微镜下拍照。(9)rt-pcr即逆转录-聚合酶链反应:提取空载体转染和mir203过表达的skov3和ovcar3细胞中的rna以及卵巢肿瘤组织中的rna,反转录系统将rna反转录成cdna,再用相应的primerpcr扩增,分析两种细胞系中mir203的表达水平以及瘦素的表达水平。(10)双抗体夹心酶联免疫吸附试验(elisa)检测血清和尿液中瘦素水平:将需要检测的抗原溶液加入96孔板中,待其充分贴壁后再进行下一步反应。在96孔板中的每个孔中加入非反应蛋白溶液,将没有完全覆盖好抗原的板底覆盖。加入特异性的一抗和连接酶至覆盖住孔。然后加酶,底物的颜色会随之而变。一抗浓度越高,则反应的就越大。同时,也可以用分光仪对颜色的改变进行测量。酶的作用可以增强反应的效果,即使很少量的酶链抗体都可以产生多种生物信号。由于认识的局限性,虽然酶可以产生出不同的颜色,但是抗体越多,颜色的改变就越快。elisa的主要缺点是缺乏特异性的抗体。抗体显色后在492nm波长处测量其免疫荧光强度,tmb反应产物需要在450nm波长出检测其强度。3.统计学方法:采用spss17.0统计软件分析数据。应用c2检验及精确概率法比较不同卵巢组织中mir-203和瘦素的阳性表达率,检验水准α=0.05,mir-203表达和正常对照卵巢癌细胞的细胞功能分析用方差t检验,p<0.05认为有统计学差异。结果1.mir-203在卵巢癌患者组织中表达异常并且和卵巢癌病人的长期存活率有关。2.snail2在人卵巢癌中表达上调并且与卵巢癌病人的短期存活率有关。3.离体培养ovcar3,skov3细胞中,mir-203抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭,增强细胞对顺铂的敏感性。4.mir-203在卵巢癌细胞系中通过抑制基因snail2的表达抑制emt,并且可以通过阻碍tgfβ诱导的emt发挥其抑癌作用。5.mir-203抑制nsg小鼠模型癌细胞肿瘤的生长。6.瘦素在卵巢癌病人血清、尿液及肿瘤在组织中表达升高。7.沉默snail2的表达可以达到mir-203在卵巢癌中的功能。结论1.miR-203在人卵巢癌细胞中通过抑制snail2基因的表达抑制EMT,从而发挥其抑癌作用。2.miR-203的表达抑制了卵巢癌细胞在小鼠体内的生长。3.结合临床标本,动物实验及离体细胞研究,我们首次发现miR-203是一个拥有巨大潜力的卵巢癌生物标记物,在卵巢癌的临床筛查,早期诊断及疗效判定等方面均具有重要意义。4.瘦素在卵巢癌病人血清、尿液和肿瘤组织中的表达升高,预示着瘦素有望可以作为卵巢癌的临床诊断指标。