在生物学基础实验研究和疾病的基因治疗中常常需要对基因表达进行时空调控。早期生长反应因子1 (early growth response-1,Egr-1)基因启动子区含有6个高度保守的CC(A + T)6GG基序(motif),可在电离辐射产生的氧自由基刺激下诱导下游基因的表达,从而实现对目的基因表达的时空调控。我们利用Egr-1启动子的这一特性,分别将人穿孔素全长cDNA和人精子蛋白17 cDNA连接到Egr-1启动子下游,构建成表达载体,对这2个基因进行了放射诱导表达研究。一、穿孔素放射诱导表达体系的初步研究穿孔素(perforin,PFN)是CTL和NK细胞杀伤靶细胞的主要毒性蛋白。PFN在肿瘤免疫中发挥着重要作用。PFN是糖基化蛋白,原核表达的PFN蛋白未能糖基化修饰可能对其活性有一定影响,我们拟采用真核表达系统表达PFN蛋白,以期在体外研究PFN蛋白对肿瘤细胞的杀伤作用。1.穿孔素真核表达载体的构建和在COS7细胞中的表达。以带有人pfn全长cDNA的质粒pCR2.1/pfn为模板进行扩增,获得PFN第64位密码子至终止密码子之间的DNA片段(去掉信号肽序列)。构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/pfn,经酶切和测序鉴定。DNA序列测定证实,扩增的pfn基因序列与国外文献报道基本一致。用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1(+)/pfn转入COS7细胞。RT-PCR检测转染细胞和对照细胞RNA。结果仅pcDNA3.1(+)/pfn转染的COS7细胞有pfn扩增带,这证明pfn在COS7细胞中有mRNA水平的表达,但用免疫细胞化学未能检测到蛋白的表达。2.穿孔素放射诱导表达载体的构建和在COS7细胞中的表达。以质粒pGEgr-1p为模板,应用Egr-1p上下游引物进行PCR扩增,获得Egr-1p扩增产物。扩增产物和质粒pcDNA3.1(+)/pfn分别经MIuⅠ、KpnⅠ双酶切消化后连接构建成pEgr-pfn重组质粒,即用Egr-1启动子代替pcDNA3.1(+)质粒的CMV启动子,构建含Egr-1启动子重组载体pEgr-pfn。经测序证实重组质粒pEgr-pfn中Egr-1p序列是完全正确的。在脂质体作用下将pEgr-pfn质粒转染COS7细胞,用X线照射诱导穿孔素表达。转染pEgr-pfn的COS7细胞可检出pfn mRNA,但用免疫细胞化学检测未见蛋白的表达。二、人精子蛋白17基因的放射诱导表达精子蛋白17(Sperm protein 17,Sp17)是一种保守的睾丸特异性蛋白,其功能主要是促进受精。近年发现该蛋白基因在一些恶性肿瘤组织中被激活并高水平表达,是一种新的癌瘤-睾丸(cancer-testis,CT)抗原。Sp17在正常组织中局限性表达和在恶性组织中异常表达,使其在肿瘤诊断和治疗中具有潜在价值,有望成为肿瘤诊断的标志和免疫治疗的靶点,尤其是对于女性肿瘤患者。为了利用Sp17作为靶标进行妇科肿瘤体内分子影像定位诊断和磁致过热治疗的实验研究,需要建立表达Sp17蛋白的卵巢癌细胞模型和动物模型,但目前尚无高表达Sp17的卵巢癌细胞系。因此,我们拟通过转基因技术将Sp17 cDNA导入卵巢癌细胞系HO8910,建立高表达Sp17蛋白的卵巢癌细胞模型。同时用Egr-1启动子替换表达载体的CMV启动子,进一步验证放射诱导基因表达的可行性。1.构建人精子蛋白17放射诱导表达载体。以pMD18T-Sp17质粒为模板,设计Sp17基因的上下游引物,在其两端分别引入NheⅠ和KpnⅠ酶切位点,经NheⅠ、KpnⅠ双酶切消化的Sp17基因和pEgr-pfn质粒连接构建成pEgr-Sp17重组质粒。pEgr-Sp17重组质粒经酶切鉴定正确后进行DNA测序。测序结果证实Sp17基因序列完全正确,成功构建pEgr-Sp17质粒。2.人精子蛋白17在卵巢癌HO8910中的稳定表达。将重组质粒pEgr-Sp17转染人卵巢癌HO8910细胞,用2Gy X线照射,免疫细胞化学法检测Sp17蛋白。在确证Sp17能瞬时表达后,继续用含G418 500μg/mL的RPMI 1640培养细胞,筛选稳定表达Sp17的细胞株。经过约40d选择培养进行检测,结果发现表达Sp17的细胞达50~60%。本试验成功构建2个放射诱导基因表达的载体,实现Sp17蛋白在卵巢癌细胞中稳定放射诱导表达。