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各种非生物逆境胁迫包括干旱、高盐、极端温度等严重影响植物的正常生长和发育，其中对农作物产量和品质的影响尤为突出。因此，非生物胁迫相关基因的克隆与功能解析，对深入阐明植物响应逆境的分子机理以及对农作物抗逆特性的遗传改良具有十分重要的意义。 本研究以模式生物二穗短柄草和烟草为材料，研究内容分为两部分。其一，从二穗短柄草中成功克隆了17个转录因子WRKY基因，并利用半定量RT-PCR技术检测了其中8个 WRKY基因在非生物逆境胁迫及信号分子处理下的表达水平以及BdWRKY36、BdWRKY45、BdWRKY47和BdWRKY67等4个转录因子蛋白的亚细胞定位及转录激活活性；进而分析了BdWRKY36转录因子在干旱逆境胁迫下的功能特性。其二，在实验室前期工作的基础上，克隆并研究了二穗短柄草蛋白激酶BdMKK6.2在干旱胁迫下的生物学功能。研究内容和主要研究结果如下： 1）通过检索 WRKY基因数据库 http://www.igece.org/WRKY/BrachyWRKY/BrachyWRKYIndex.html，获得二穗短柄草 BdWRKYs基因序列，将 BdWRKYs序列与植物基因组数据库Eensembl Plants（http://plants.ensembl.org/index.html）中的二穗短柄草基因组进行比对分析，并以BdWRKYs序列和比对到的序列为基础设计特异引物，利用RT-PCR技术，克隆得到17个WRKY基因的cDNA序列。经过生物信息学分析，发现这些基因涵盖了 WRKY转录因子的三种类型。其中，BdWRKY27、BdWRKY45、BdWRKY46、BdWRKY46、BdWRKY67蛋白属于I类，BdWRKY39、BdWRKY4、BdWRKY21、BdWRKY36属于 II类，BdWRKY10、BdWRKY17、BdWRKY19、BdWRKY20、BdWRKY22、BdWRKY40、BdWRKY78、BdWRKY79属于III类。 2）通过半定量RT-PCR技术检测了8个BdWRKYs基因在二穗短柄草不同器官的表达模式以及在干旱、高盐、极端温度等非生物逆境胁迫以及信号分子 ABA和H2O2处理下的表达变化。发现不同的基因在不同器官中的表达量有较大的差异，大部分基因（BdWRKY21、BdWRKY36、BdWRKY40、BdWRKY45、BdWRKY47)在根、茎和叶中表达量较高，而BdWRKY67、BdWRKY79在幼穗中的表达较高。BdWRKY36、BdWRKY45、BdWRKY67、BdWRKY79都受干旱诱导表达上调；所有的8个 WRKY基因都在一定程度上受低温胁迫诱导表达上调；6个基因(BdWRKY36、BdWRKY39、BdWRKY40、BdWRKY45、BdWRKY47、BdWRKY67)受高温胁迫的诱导表达上调；仅有2个基因BdWRKY45、BdWRKY79受高盐胁迫诱导表达上调；基因BdWRKY39受ABA诱导表达上调，BdWRKY40受 H2O2诱导表达上调。然而一些基因的表达水平也明显地受到某个或某些处理的影响而使表达下调。例如，BdWRKY79受高温胁迫的影响表达下调；BdWRKY36、BdWRKY47基因受ABA胁迫处理下调。这些结果表明，二穗短柄草大部分WRKY基因都能够响应多种非生物胁迫，且其所响应的非生物逆境及信号分子存在较大差异。 3）通过洋葱表皮的瞬时表达实验和酵母细胞的转录激活实验对BdWRKY36、BdWRKY45、BdWRKY47和BdWRKY67转录因子进行了亚细胞定位分析及转录激活活性检测。结果表明，这4个转录因子均定位于细胞核，而不同的蛋白有不同的转录激活区域，BdWRKY36和BdWRKY47转录激活区域位于 C端，BdWRKY45和BdWRKY67的转录激活区域位于N端，并且BdWRKY36和BdWRKY67都含有抑制区域，说明不同的BdWRKYs转录因子发挥功能的机制可能有所不同。 4）深入分析了BdWRKY36基因在响应干旱逆境下的表达特性及其生物学功能。该基因在干旱处理下，迅速被诱导表达上调，处理1小时后即达到最高值，为原来的5.4倍，而后逐渐降低，6小时后为原来的2倍。在烟草中过表达BdWRKY36基因能够增强转基因植物对干旱逆境胁迫的耐受程度。具体的表现为：在控水处理20天后，转基因烟草比野生型烟草具有更高的存活率、叶绿素含量和相对含水量，并且表现出更强的抗氧化酶活性，同时具有更低的离子渗漏率和活性氧的积累水平。超氧阴离子和过氧化氢的组织定位染色结果表明，在干旱处理下，BdWRKY36基因的过表达能够显著降低转基因烟草体内的超氧阴离子和过氧化氢的积累程度。与活性氧清除相关和逆境胁迫反应相关基因的表达分析表明，在干旱条件下，转基因烟草活性氧清除相关基因NtSOD、NtPOX和NtCAT以及逆境反应相关基因NtLEA5、NtNCED1和NtDREB3的表达量都显著高于野生型。以上结果表明，烟草中过表达BdWRKY36基因能够显著增强植物对干旱胁迫的耐受能力。该基因赋予植物对干旱胁迫的耐受性是通过调控抗氧化系统基因及防御相关基因表达水平，从而降低 ROS积累、有效减轻细胞的氧化损伤实现的。 5）同时，本文还研究了二穗短柄草MAPKK家族的一个成员BdMKK6.2蛋白激酶基因的表达模式、亚细胞定位及生物学功能。结果表明，BdMKK6.2基因的表达量在幼叶中较高，且在PEG6000的处理下表达下调。亚细胞定位分析表明，BdMKK6.2蛋白主要定位于细胞质。转基因烟草中过表达 BdMKK6.2能够显著降低植物对渗透和干旱胁迫的耐受能力，具体表现为：在高渗条件下，转基因烟草的发芽率显著低于野生型烟草；在干旱条件下，转基因烟草的生长状况较差，且干旱3周后的成活率显著低于野生型，而失水率、离子渗漏、丙二醛含量以及活性氧的积累水平显著高于野生型；同时转基因烟草活性氧产生相关基因NtRbohD和NtRbohF的表达水平显著高于野生型。以上结果表明，烟草中过表达 BdMKK6.2基因能够明显增强植物对高渗胁迫的敏感性，显著降低植物对干旱胁迫的耐受能力，该基因降低植物对干旱逆境的耐受性可能是通过上调活性氧产生相关基因的表达水平从而影响了活性氧平衡以及下调逆境反应相关基因的转录水平所导致的。