甾体类激素受体(steroid hormone receptor,SHR)属于核受体家族,是一类配体依赖性的转录调节因子,可以通过调节基因表达来调控有机体的生长发育和代谢,广泛参与免疫、炎症反应和药物代谢,在维持机体的稳态中发挥重要作用。SHR在前列腺癌、乳腺癌和糖皮质激素抵抗症等多种常见疾病的发生发展中发挥了重要作用。越来越多的异常受体在相关疾病中被发现,这些异常受体被认为是疾病发生发展以及内分泌治疗抵抗的重要机制之一。双荧光素酶报告基因系统是一种常用的体外检测基因功能的方法。该检测系统往往需要同时转染三个不同的质粒进入细胞,其缺点包括:同时转染三个质粒的效率较低;各个质粒的转染效率不稳定导致结果不稳定;不同的质粒配比使得结果有所差异,不易于实验之间的相互比较。因此,在第一部分研究中我们对传统的双荧光素酶报告基因系统进行改进,将待测基因、启动子以及两种报告基因共同构建在同一真核细胞转染质粒上,建立了一个简单、通用的甾体类激素受体的功能检测平台,同时利用该检测系统对多种与疾病相关的雄激素受体(androgen receptor,AR)、雌激素受体(estrogen receptorα,ERα)和糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)的变异体和突变体进行了功能检测。研究结果显示,本检测系统仅需转染一种质粒进入HEK293T细胞即可对待测基因进行功能检测,操作方便,结果稳定。利用该检测方法,本研究证实9种AR变异体(AR-V4,AR-V5,AR-V6,AR-V7,AR-V8,AR-V9,AR-V11,AR-V12 和 ARQ640S)和 3 种 AR 突变体(W742C,T877A和W742C-T877A)具有不依赖雄激素的激活能力;6种ERα突变体(S463P-D538G,Y537N-D538G,Y537S-D538G,Y537N,Y537S 和 D538G)和 1 种 ERα剪切变异体(ERα-V5)具有雌激素非依赖的激活能力。此外,在雌激素存在的情况下,2种突变体(Y537K和D538N)和4种剪切变异体(TIDDA,ERα-36,ERα-46和ERα-V6)的激活能力显著高于野生型ERα;而GR剪切变异体和突变体中仅GR-B具有激素非依赖性激活能力。本研究表明,新建立的双荧光素酶报告基因系统可以灵敏而有效的检测甾体类激素受体的功能。该检测平台验证了一些已经被证实具有激素非依赖激活能力的变异体的功能,还发现了一些鲜为报道的变异体和突变体具有激素非依赖的转录激活能力,阐释了它们在疾病发展和治疗抵抗中的潜在作用。该系统的建立,为今后更多变异体或者突变体功能的检测和比较提供了良好的实验平台,同时,也为未来研究相关疾病潜在的治疗靶点提供了可信的实验基础。人类嗜T淋巴细胞病毒I型(human T-cell lymphotropic virus,HTLV-1)是首个被发现与癌症相关的RNA逆转录病毒。部分感染HTLV-1的人群可发展成为成年人T淋巴细胞白血病(adult T-cell leukemia,ATL)、相关性脊髓病和/或热带痉挛性瘫痪(HTLV-1 associated myelopathy/tropicalspasticparaparesis,HAM/TSP)等相关疾病。由于HTLV-1能够通过性传播、经血传播和垂直传播等方式传染给其他人,因此,许多发达国家将HTLV-1抗体筛查纳入常规血液筛查项目。蛋白免疫印迹(Western blot,WB)和条带免疫印迹(Lineimmunoassay,LIA)是两种主要的对初筛反应性样本进行确认的方法,但都会产生大量不确定和不能分型的结果,从而对有效判断机体是否感染病毒造成困扰。HTLV-1前病毒载量(Proviral load,PVL)的检测不仅可以对初筛反应性样本进行确认,也可以帮助判断患者的预后以及指导感染者的治疗。TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术具有很高的灵敏度和特异性,广泛应用于核酸的定性和定量检测。因此,在第二部分的研究中,我们基于HTLV-1保守区域(pol区和tax区)和内参基因RPPH1设计了多对引物和探针,通过筛选合适的引物和探针,以及对其浓度和检测体系的退火温度进行优化,建立了一种定量检测HTLV-1前病毒的方法。本研究定量检测结果以外周血单个核(PBMC)细胞数量为分母,以感染HTLV-1的细胞数作为分子,最终基于每个PMBC中内参基因RPPH1拷贝数为2,从而相对定量每个细胞中HTLV-1的拷贝数。随后,本研究对建立的检测方法进行了灵敏度、特异性、精密度等一系列方法学评价,并利用该检测方法对临床样本进行了定量检测。结果显示,本方法线性范围较广,可达到2.5×108 copies/reaction～15 copies/reaction;本方法对其他病毒阳性的样本均无非特异性反应,特异性好;正确度、精密度和重复性均良好。Hut102细胞是一株可释放HTLV-1的T细胞淋巴瘤细胞系,经数字PCR绝对定量,Hut102细胞中HTLV-1的平均拷贝数为1.146 copies/cell。将Hut102细胞与不含HTLV-1的T细胞淋巴瘤细胞Jurkat以不同比例混合,利用本研究建立的方法,可最低检出的Hut102细胞终浓度为0.0218%(95%置信区间0.0179～0.0298%),即在104个细胞中可检测到2.5个拷贝的HTLV-1(0.025 copies/100 cells),满足临床检测需求。此外,本方法对41例LIA不确定(30例)和阳性(11例)的全血样本进行了检测。结果显示,在11例LIA阳性样本中共检出7例HTLV-1阳性样本(其中包含1例未分型样本),该7例样本中4例WB结果为阳性,3例为WB不确定,平均PVL为3.10 copies/100 cells。说明该方法可对HTLV阳性样本,特别是WB不确定样本进行分型和定量。30例LIA不确定样本的核酸定量均为阴性,这可能是由于患者的非特异性反应从而产生不确定结果,也可能是病毒载量较低难以进行核酸定量。因此,对于不确定样本,我们需要进行更长期的随访和监测。综上所述,本研究建立了基于Taqman探针的一种可定量每个细胞中HTLV-1病毒拷贝数的qPCR方法。鉴于其检测成本较低,灵敏度高、特异性好、检测方便、快速等特点,本研究期望将该方法应用于初筛反应性献血者样本的补充实验,qPCR结果阴性的样本再进一步用免疫印迹的方法进行确证。该策略既可对阳性样本进行定量和分型,又可减少蛋白免疫印迹的使用次数,缩短检测时限的同时也降低了确证试验所需的费用。另外,由于PVL的变化可成为相关疾病发生和发展的重要预测因子,因此,本方法为长期监测HTLV-1感染者的PVL提供了有效途径。