乳酸菌表达质粒载体组成型启动子的克隆及表达的初步研究

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人们普遍认为大部分乳酸菌是安全的益生菌。利用某些乳酸菌可以在胃肠道、泌尿、生殖系统中或粘膜部位黏附存活且无病原性等特点,以乳酸菌作为活菌口服疫苗或粘膜疫苗载体的研究受到了研究者们广泛的重视。乳酸菌活菌携带抗原可以诱导免疫反应在不同的实验室得到了证明,且乳球菌在选择抗原诱导免疫反应方面比乳杆菌更加有效。 本实验室已经从乳酸菌保健品中分离筛选到两株可以作为受体菌株的乳酸菌。一株ASl.2984和一株ASl.2986。在乳酸菌中表达目的蛋白,圈际上常采用Nisin诱导型表达质粒。但该质粒转入这两株乳酸菌之后,却无法得到蛋白质的高表达,乳酸菌口服疫苗的研究也无法展开。为了解决这个问题,探索构建组成型表达质粒。组成型表达质粒相对于诱导型表达质粒,优越性在于进行口服疫苗实验时不用再喂服任何诱导物质,可以使实验更简单。 采制了鸟枪法试图克隆能存乳酸菌中组成型表达的启动子功能片段。以质粒pNZ8037为基础与来自pUC1l9的缺矢启动子的β-内酰胺酶基因作报告基因构建了乳酸菌启动一f探测载体pNZ8037.△PAmp。pNZS037能在乳酸乳球菌、乳酸杆菌.枯草芽孢杆菌等多种革兰氏阳性菌和大肠杆菌中稳定复制、存在,是一个广泛宿主范围的质粒。这样既扩大了探测载体的宿主范围,又省去了重组质粒从大肠杆菌转移到乳酸菌等其他菌时的亚克隆步骤。来自粪肠球菌Enterococc~sfacallsASl.2984的总DNA经Sau3i~,酶切后克隆进pNZS037.△PAmp探删载体,获得一系列长短不同的插入片段.这些插入片段均能启动β-内酰胺酶基因的表达,序列分析的结果表明插入片段pNZ8037-P一△PAmp-2具典型的启动子序列结构。 由于乳酸菌的益生性,也尝试以乳酸菌为载体进行肿瘤治疗的初步研究。 乳酸菌肿瘤治疗的一个条件是乳酸菌能够在肿瘤中聚集,在喂服肿瘤老鼠乳酸菌后,发现粪肠球菌ASl.2984在肿瘤中有一定程度的聚集,粪肠球菌ASl.2984在其它器官中则不会聚集。 因而,乳酸菌作为口服疫苗和肿瘤治疗的载体,有一定的研究和实践价值。
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