生物催化又称为生物转化,即是利用细胞或酶做催化剂来实现化学转化的工程。近年来,随着人们对生物催化和转化的不断探索,生物催化和生物转化的工业应用迅速发展。由于生物催化和转化技术安全性能较好、研发周期短、研发投入少、回报高,并且环境污染小,在国内又有良好的产业基础,所以可以视为一个长期发展的项目。因此,本文尝试从近平滑假丝酵母中克隆假定短链脱氢酶基因,并测定其的酶学性质：分析得到的短链脱氢酶基因的氨基酸序列结构,找出其活性位点,并对其进行突变,得到突变效果较好的新突变蛋白；通过构建葡萄糖脱氢酶和短链脱氢酶酶的多顺反子载体,形成辅酶再生系统,大大减少了辅酶的利用率,降低了成本,提高了产率。实验通过基因重组使大肠杆菌获得近平滑假丝酵母Candida parapsilosis的短链脱氢酶基因(CPE),经IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导表达产生短链脱氢酶,结合NADPH辅酶系统,以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为底物,获得产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)。这种酶催化产生的(S)-CHBE的e.e.值高于99%,能把90%以上的底物COBE转化成所需产物,且Km值明显低于其它同种类的酶,更适合底物流加的催化制备模式,在实际生产中有很高的实用价值。实验通过对CPE及其同源蛋白二级序列及其保守区域的分析,确定其属于短链脱氢酶。利用二次PCR的方法突变其第126位的丝氨酸和第195位的甘氨酸,得知第195位的氨基酸是蛋白的关键氨基酸,可以影响底物谱、辅酶结合位点以及底物耐受性、酶活、手性的变化。得到表型良好的两株突变株G195A和G195S,和同样反应体系的CPE相比,转化率不仅增长了10%左右,而且可以利用NADH代替NADPH,减少催化生产中所需的成本,在实际应用中有重要意义。实验成功构建了pETduet-CPE-GDH2和pETduet-CPE-GDH4两个共表达体系,并导入大肠杆菌中同时诱导表达,实现了NADPH的辅酶再生系统,降低了成本,提高了转化率。而且在利用辅酶方面,可以利用更经济的NADP来替代NADPH,这样不仅反应效率提高,反应成本也相对的降低。