DMRT(DoublesexandMab-3relatedtranscriptionfactors)基因家族是一个与生长发育、疾病发生，特别是与动物性别决定及分化密切相关的家族。迄今为止，在无脊椎与脊椎动物中共发现有40多个DMRT成员。该家族成员的主要特征是具有一个比较保守的DM结构域，能识别特异的DNA序列。生物信息学分析发现DMRT基因在最早的多细胞腔肠动物就已出现且与有性生殖相关。目前对DMRT基因在性别决定与分化中的作用研究主要集中于Dmrt1，对其他成员的研究较少。为研究DMRT基因在鱼类性别决定与分化及性腺发育过程中的潜在作用，我们分离了尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)所有DMRT家族成员，对其基因结构、共线性及系统发生关系、性腺转录组表达水平进行分析，并通过TALEN(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases)研究Dmrt4/Dmrt6在性腺发育中的可能作用。　　 通过性腺转录组与基因组结合，我们在尼罗罗非鱼中分离到7个DMRT成员，分别是Dmrt1、Dmrt2a、Dmrt2b、Dmrt3、Dmrt4、Dmrt5和Dmrt6。其中Dmrt2a与Dmrt2b是一种复制，Dmrt2b在四足类不存在，我们推测Dmrt2b可能为鱼类特有。首次发现Dmrt6也存在于真骨鱼中，但目前仅从丽鱼科中分离到，导致这种现象的原因可能有两个:一是Dmrt6在其他鱼类发生了次生性的丢失;二是基因组测序不完全而没有分离到Dmrt6。序列比对分析发现，尼罗罗非鱼Dmrt6与哺乳类Dmrt6相似度高达60％以上。系统发生及共线性分析表明尼罗罗非鱼所有DMRT基因是四足类的同源基因。通过8个性腺转录组分析发现，尼罗罗非鱼有5个DMRT成员在性腺中表达，其中Dmrt1、Dmrt5和Dmrt6在雄性中的表达高于雌性，Dmrt2a和Dmrt4在雌性中的表达高于雄性。　　 本研究通过RT-PCR、Real-timePCR、原位杂交与免疫组化等技术分析了尼罗罗非鱼Dmrt4/Dmrt6的表达模式。组织表达模式表明Dmrt4除主要表达于卵巢外，还在鳃和肌肉中少量表达;Dmrt6除主要表达于精巢外，还在脑、垂体等组织中表达。Real-timePCR分析表明在正常性腺中，Dmrt4和Dmrt6分别在70dah(daysafterhatching)卵巢与90dah精巢中开始高表达;Dmrt4在Fadrozole诱导原发性逆转雄性(XX)性腺中的表达低于正常雌性，而在雌二醇(E2)诱导原发性逆转雌性(XY)性腺中的表达高于正常雄性;Dmrt6在Fadrozole诱导原发性逆转雄性(XX)性腺中的表达高于正常雌性，在雌二醇(E2)诱导原发性逆转雌性(XY)性腺中的表达低于正常雄性;由此可见罗非鱼Dmrt4和Dmrt6的表达均与表型相关。原位杂交与免疫组化分析均表明Dmrt4主要在一、二时相卵母细胞中表达，Dmrt6主要在精母细胞中表达。启动子分析发现尼罗罗非鱼Dmrt4不能调控雌激素合成酶Cyp19a1a的转录;而Dmrt6抑制Cyp19a1a的转录且有剂量依赖反应。为进一步研究Dmrt6在性腺发育中的作用，采用TALEN(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases)技术对Dmrt6进行了基因敲除。结果显示TALEN能高效地对Dmrt6基因进行编辑。与对照组相比，3月龄Dmrt6敲除个体精巢中出现了异常，精母细胞较少，输精管发育不正常;免疫组化检测发现Dmrt6敲除后Cyp11b2与Dmrt1的表达有所下调，而Amh与对照组相比无明显差异。　　 综上所述，本研究在尼罗罗非鱼基因组中分离到7个DMRT基因，其中Dmrt6为除四足类外首次在真骨鱼中发现，生物信息学分析表明罗非鱼Dmrt6是四足类的同源基因。转录组分析发现有5个DMRT基因在性腺中表达，它们可能在尼罗罗非鱼性腺发育、性别决定与分化中起重要作用。原位杂交与免疫组化表明Dmrt4主要在卵母细胞中表达，而Dmrt6主要精母细胞中表达，两者的表达均与表型相关。启动子分析发现Dmrt4可能不参与雌激素合成酶Cyp19a1a的转录调控，Dmrt6对Cyp19a1a的转录有抑制作用。Dmrt6基因敲除后性腺的初步检测结果表明Dmrt6基因突变会导致精母细胞的减少和输精管的不正常发育，所以，我们推测Dmrt6可能参与精子发生及输精管的发育。