研究背景及目的:脓毒症(sepsis)是一种临床上常见的危重病症,具有发病率高,死亡率高的特点。存在于革兰氏阴性菌细胞外膜主要成分之一的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),也称内毒素(endotoxin),是脓毒症发生的主要始发因子,从源头上阻止脓毒症的发生即封闭LPS触发的炎症瀑布反应是对抗脓毒症的有效手段之一。课题组在前期研究中,针对与LPS具有高亲和力的鲎抗内毒素因子(limulus anti-lipopolysaccharide factor, LALF)开展广泛研究,以LALF为模板并采用计算机模拟设计并合成数十条多肽,并优选出一条中和LPS能力强,安全性高的19个氨基酸残基的环状鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19。在前期研究过程中发现CLP-19提前20h给予对大肠埃希菌急性腹膜炎小鼠具有较好的保护作用,可显著提高其生存率;且在细胞水平仍能抑制可LPS结构完全不同的IL-1β刺激的RAW264.7细胞TNF-α水平升高,提示CLP-19可能具有一定的免疫调节作用并通过该调节作用抑制LPS的免疫应答。本研究在前期工作的基础上,通过观察CLP-19对LPS诱导PBMC的MAPK信号通路和细胞因子的调节作用;与单核/巨噬细胞结合,并观察CLP-19预处理对细胞炎症因子和趋化因子表达的影响及对LPS所诱导的免疫反应的作用,在体研究CLP-19预保护动物对LPS所介导的炎症反应的作用;以初步阐明CLP-19抑制LPS免疫应答的作用。实验方法:第一部分:CLP-19对LPS诱导PBMC细胞炎症信号通路的影响1. CLP-19对LPS诱导PBMC细胞MAPK信号通路磷酸化水平的影响:通过观察LPS作用于PBMC细胞后不同时间点(0min, 10min, 20min, 30min, 60min)MAPK通路(p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-P38)磷酸化水平,以选择合适观察时间点;并观察不同浓度(25μg/ml, 50μg/ml, 100μg/ml)的CLP-19对LPS所诱导MAPK通路磷酸化水平影响,以相同浓度多粘菌素B(PMB)为对照。2. CLP-19对LPS诱导PBMC细胞细胞因子、趋化因子mRNA表达水平的影响:以不同浓度组(25μg/ml, 50μg/ml, 100μg/ml)的CLP-19及LPS(100ng/ml)作用PBMC,4h行RT-PCR,观察不同细胞因子MCP-1、TNF-α、IL-10、IL-6、ICAM-1的变化情况。第二部分:CLP-19对LPS刺激单核/巨噬细胞的免疫应答的影响一、CLP-19对LPS与RAW264.7细胞结合的影响1.流式细胞技术观察CLP-19对LPS与RAW264.7结合的影响:在不含血清条件下,将罗丹明标记的CLP-19 (R-CLP-19,10μg/ml)和FITC-LPS (1μg/ml)先后或同时与细胞孵育,流式观察CLP-19或LPS与细胞结合情况。并以有血清的存在下,观察R-CLP-19与FITC-LPS与细胞结合情况为对照。2.激光共聚焦技术观察CLP-19对LPS与RAW264.7细胞结合的影响在无血清的条件下,观察不同浓度(10μg/ml、100μg/ml)的CLP-19对FITC-LPS (1μg/ml)与RAW264.7的结合的影响,并以有血清存在作为阳性对照。二、CLP-19抑制LPS所诱导的RAW264.7细胞免疫应答作用研究1. RT-PCR观察CLP-19单独作用RAW264.7细胞因子、趋化因子mRNA水平的影响考察固定浓度(50μg/ml)的CLP-19作用于RAW264.7细胞后0.5h、1h、2.5h、5h、10h、20h的不同时间,及不同浓度(1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的CLP-19作用于RAW264.7细胞20h,观察细胞TNF-α、IL-10、MCP-1、ICAM1的mRNA水平的变化情况。另对(50μg/ml)的CLP-19的CLP-19预处理细胞5h、10h、20h后,清洗细胞再以LPS刺激,4h后提取细胞RNA,观察上述细胞因子的变化,以CLP-19与LPS预混组为对照。2. Real-Time PCR分析CLP-19对LPS刺激RAW264.7细胞炎症因子、趋化因子mRNA水平的影响:考察不同浓度(1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的CLP-19单独作用于或与LPS(100ng/ml)共同作用于RAW264.7,4h后提取细胞RNA,观察TNF-α、IL-1、MCP-10的mRNA水平的变化情况,并以同剂量组的cLALF为对照。3. ELISA观察CLP-19对RAW264.7细胞MCP-1释放的影响:通过观察相同剂量(100μg/ml)的CLP-19和cLALF及LPS作用于RAW264.7细胞,于不同时间点(0 h、6 h、12 h、24 h)测定MCP-1的释放影响;并在此基础上,选择对MCP-1调节能力较好的CLP-19在不同浓度下(25μg/ml, 50μg/ml, 100μg/ml)对有无LPS存在下释放MCP-1的影响。4. Transwell法观察CLP-19 RAW264.7趋化作用的影响:趋化小室法观察不同浓度的CLP-19 (1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)对RAW264.7定向移动能力的影响。第三部分:CLP-19预保护小鼠对LPS刺激的免疫应答作用初探相同剂量(2mg/kg)的CLP-19或cLALF分别于提前20 h、10 h、5 h作用于小鼠,再给予亚致死剂量LPS,分别于LPS刺激前(0 h点)及刺激后4 h分离小鼠血清,ELISA法测定MCP-1、TNF-α及IL-10的变化情况,并以LPS与CLP-19或cLALF混合后同时给予为对照。组织病理学观察小鼠重要脏器(肝、肺、肾、小肠、心)的变化情况。结果:第一部分:CLP-19抑制LPS对PBMC细胞炎症信号通路及细胞因子的作用研究1. CLP-19可显著抑制LPS MAPK信号通路磷酸化水平:经Western bloting研究发现,LPS作用于PBMC细胞30min后MAPK通路(p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-P38)磷酸化水平呈显著增加(P<0.01);所考察的CLP-19各组(25μg/ml, 50μg/ml, 100μg/ml)均可显著抑制LPS致MAPK通路激活,且呈剂量依赖效应,该作用与多粘菌素B(PMB)阳性对照相当。2. CLP-19可显著抑制LPS致细胞因子、趋化因子mRNA水平:CLP-19对LPS作用PBMC的细胞因子(TNF-α、IL-10、IL-6)、趋化因子(MCP-1)、黏附因子(ICAM1) mRNA水平呈显著抑制作用(P<0.01),且该作用呈显剂量依赖关系(P<0.01)。第二部分:CLP-19对LPS刺激单核/巨噬细胞的免疫应答作用研究1. CLP-19对LPS与RAW264.7结合的影响:流式细胞技术和激光共聚焦研究结果表明,在有血清存在下,LPS或CLP-19单独或两者同时存在下均能与细胞结合;而在不含血清条件下,LPS不能直接与RAW264.7细胞结合,但CLP-19可与RAW264.7细胞结合,且能介导LPS与RAW264.7细胞结合;且无论CLP-19先加入还是LPS先加入,两者在同时存在下均能与RAW264.7细胞结合。2. CLP-19对RAW264.7细胞因子、趋化因子mRNA水平的影响CLP-19单独作用于RAW264.7细胞研究结果显示,CLP-19对MCP-1的mRNA调节呈显著的时间依赖性和剂量依赖性,高剂量的CLP-19可上调ICAM-1、TNF-α和IL-10的mRNA水平。以CLP-19预处理RAW264.7细胞的不同时间(5h、10h、20h),其均可显著抑制LPS所刺激的炎症因子上调,各预处理组间无统计学差异。3. CLP-19对RAW264.7细胞MCP-1释放的影响: CLP-19和cLALF单独作用下可显著上调MCP-1水平,但该作用显著低于LPS的诱导分泌能力,cLALF诱导MCP-1产生能力也显著低于CLP-19的诱导能力(P<0.01);CLP-19在LPS存在下,一方面CLP-19可中和LPS,抑制其诱导水平,另一方面,游离的CLP-19或LPS也可作用于细胞,诱导MCP-1产生,该作用呈显著剂量依赖效应。4. CLP-19对RAW264.7细胞有一定的趋化作用:趋化小室法研究发现,较高浓度的CLP-19 (10μg/ml、100μg/ml)对RAW264.7有一定的趋化作用,诱导RAW264.7细胞产生定向移动,但该作用低于阳性对照血清组。第三部分:CLP-19预保护小鼠对LPS免疫应答作用初探1. CLP-19或cLALF预处理小鼠无明显致炎作用提前20 h、10 h或5 h给予的CLP-19或cLALF小鼠各组间TNF-α、IL-10显著抑制,但提前5h给药后小鼠TNF-α有显著升高(P<0.01),CLP-19、cLALF各组间20 h、10 h、5 h均可显著上调MCP-1的表达,在相同时间点CLP-19调节MCP-1能力显著强于cLALF。2. CLP-19或cLALF预处理小鼠对LPS致炎作用的调节提前20 h、10 h、5h或同时给予CLP-19或cLALF的各组间均可显著下调TNF-α、IL-10和MCP-1的水平,以同时给药作用最为显著,其次为提前20h给予组;3. CLP-19与cLALF对小鼠肝脏有轻微病理改变外,其余脏器无病理改变,LPS组小鼠肺、肝、肾均出现炎症性病理改变,尤以肺脏和肝脏明显,提前给予CLP-19或cLALF组各脏器病变程度显著减轻。结论:1.鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19可显著抑制PBMC细胞对LPS诱导的免疫应答;2. CLP-19可抑制LPS对RAW264.7细胞的免疫应答: (1) CLP-19可与RAW264.7细胞结合且能介导LPS与细胞结合; (2) CLP-19可显著上调RAW264.7趋化因子MCP-1 mRNA水平、促进细胞MCP-1蛋白的分泌,该作用呈显著的时间依赖和剂量依赖效应; (3)以CLP-19预处理RAW264.7细胞,可改变细胞免疫状态,抑制LPS所介导的免疫应答3. CLP-19预处理小鼠可显著提高小鼠MCP-1的表达,且该作用呈时间依赖效应,并抑制小鼠机体对LPS的免疫应答,从而降低机体炎症水平。