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白藜芦醇(Resveratrol,Res)是一种具有多种生物活性的天然多酚类物质,本实验室前期研究发现,白藜芦醇通过影响大鼠肝、肺组织内TLR4/NF-κBp65/MAPKs通路的信号级联作用,调控相关基因IKBα、P38、JNK、ERK1、ERK2和ERK5等的转录与表达,最终调节炎症因子IL-1、IL-6、IL-8、COX2等的释放与表达来发挥抗炎活性。本研究拟在细胞水平上,建立脂多糖刺激的RAW264.7细胞炎症模型,通过WB、RT-PCR等实验技术,研究白藜芦醇对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症TLR4-NF-κB/MAPKs/IRF3通路信号转导的影响,确定白藜芦醇发挥作用的途径;在此基础上,加入通路特异性抑制剂SP600125、BAY11-7082、SB203580,检测TLR4/NF-κB/MAPKs通路中重要蛋白表达情况,确证白藜芦醇影响的通路及作用效果;最后检测相关炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α的转录与分泌情况,阐明白藜芦醇发挥抗炎作用与炎症因子分泌之间的关系,以揭示白藜芦醇对LPS诱导RAW264.7细胞炎症损伤的保护作用机制。主要研究内容及结果如下:1 RAW264.7细胞炎症模型的建立及白藜芦醇用药浓度的筛选培养RAW264.7细胞,分别采用CCK-8法、ELISA法检测不同浓度LPS、白藜芦醇对RAW264.7细胞活性及炎性介质TNF-α、IL-6分泌的影响,确定合适的造模方法及白藜芦醇使用浓度。结果显示:LPS浓度≤2.5μg/ml时,对RAW264.7细胞无毒性,白藜芦醇浓度在12.5-200μmol/L时,对RAW264.7细胞无毒性。LPS以剂量依赖的方式促进TNF-α和IL-6的分泌,加入6.25-50μmol/L白藜芦醇,显著降低LPS所诱导的炎症介质TNF-α、IL-6的分泌。以上结果表明:可通过加入500 ng/ml LPS与RAW264.7细胞共同作用12h制造细胞炎症模型;白藜芦醇用药浓度范围为6.25-25μmol/L。2白藜芦醇对LPS诱导RAW264.7细胞炎症TLR4-NF-κB/MAPKs/IRF3信号通路的影响2.1白藜芦醇对LPS诱导RAW264.7细胞炎症NF-κB/MAPKs/IRF3信号通路的影响:对LPS刺激后的RAW264.7炎症细胞进行研究,运用Western blot实验技术和RT-PCR技术,检测不同浓度白藜芦醇处理后NF-κB/MAPKs/IRF3信号通路相关蛋白I?Bα、p65、P38、JNK、ERK1/2、IRF3的表达情况。结果显示:经LPS刺激后,细胞内I?Bα、p65、P38、JNK、ERK1/2、IRF3磷酸化蛋白的相对表达均明显升高,而白藜芦醇可以降低NF-κB/MAPKs/IRF3信号通路下游相关蛋白I?Bα、p65、P38、JNK、ERK1/2、IRF3磷酸化水平。由此可见,白藜芦醇主要通过抑制NF-?B、MAPKs通路信号传递发挥抗炎作用。2.2白藜芦醇对LPS诱导RAW264.7细胞炎症上游MYD88依赖/非依赖性信号通路的影响:运用Western blot实验技术和RT-PCR技术,检测不同浓度白藜芦醇处理后TLR4-MYD88依赖/非依赖性通路中TLR4蛋白表达及基因TLR4、MyD88和TRAM转录情况。结果显示:白藜芦醇可以下调TLR4蛋白的表达,抑制TLR4、MyD88和TRAM mRNA的转录。由此可见,白藜芦醇可以通过TLR4信号通路介导炎症,影响MyD88和TRAM基因mRNA转录,抑制MyD88依赖和TRIF依赖信号通路,进而使下游NF-?B和MAPKs、IRF3通路的激活受到抑制。3白藜芦醇对LPS诱导RAW264.7细胞炎症损伤通路抑制作用验证及效果研究分别用NF-κB通路特异性抑制剂(BAY11-7082)、P38通路特异性抑制剂(SB203580)、JNK通路特异性抑制剂(SP600125)和25μmol/L白藜芦醇处理细胞,运用Western Blot技术检测通路中相关蛋白I?Bα、p65、P38、JNK表达情况。结果显示:白藜芦醇与NF-κB、MAPKs信号通路抑制剂类似,均可抑制RAW264.7炎症细胞中IκBα、p38、JNK等蛋白磷酸化水平。由此可见,白藜芦醇主要通过抑制NF-κB、MAPKs信号通路的信号传导发挥细胞炎症损伤保护作用,其具有与抑制剂相似的抗炎作用效果。4白藜芦醇及特异性抑制剂对LPS诱导RAW264.7细胞炎症炎性因子转录及分泌的影响分别运用RT-PCR、ELISA实验技术检测经白藜芦醇与特异性抑制剂BAY11-7082、SB203580、SP600125处理后,RAW264.7细胞中相关炎症因子IL-8、IL-6、IL-10、IFN-β、TNF-αmRNA的表达及分泌情况。结果表明:白藜芦醇与NF-κB、MAPKs信号通路抑制剂类似,能显著下调炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-βmRNA的表达,上调抗炎因子IL-10 mRNA的表达;白藜芦醇与NF-κB、MAPKs信号通路抑制剂均可显著抑制LPS刺激引起的炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β分泌,明显提高抗炎因子IL-10的释放。由此可见,白藜芦醇及各种抑制剂均可显著下调RAW264.7炎症细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β基因转录,上调抗炎因子IL-10基因转录,从而调节炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β和IL-10的释放发挥抗炎作用。综上所述,白藜芦醇通过影响TLR4、MyD88、TRAM mRNA转录和TLR4蛋白质的翻译抑制TLR4信号通路的激活,进一步通过TLR4-NF-Κb/MAPKs/IRF3信号级联作用,抑制通路中相关蛋白I?Bα、p65、P38、JNK、ERK1/2、IRF3磷酸化水平,最终调控炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β和IL-10的释放发挥炎症损伤保护作用。