法尼基焦磷酸合成酶基因的原核表达及功能分析

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陆地棉是世界最重要的纤维和油料经济作物,但是其产量受到害虫和病原菌的严重威胁。蚜虫和棉铃虫作为主要的农业害虫,使得每年陆地棉产量遭遇巨大损失。但是,由于害虫抗药性的出现以及农药对其他有机体(例如人和动物)的负面作用,长远来看,杀虫剂在害虫防治方面不是最好的选择。当被害虫取食后,植物会散发一系列有机挥发物,这些挥发物可以吸引害虫的天敌,从而击退害虫。因此,能够调节虫害诱导挥发物释放的基因的发掘与鉴定对于我们研究植物的自我防御的分子机制是相当重要的。  在本研究中,分别克隆和鉴定了陆地棉中2个FPSs基因——GhFPS1和GhFPS2,并对其基因序列特征、基因表达特点、酶活力以及烟蚜茧蜂对(E)-β-法尼烯的电生理和趋向反应等方面做了全面研究。主要结果如下:  1.陆地棉FPS基因的克隆及序列分析:在NCBI数据库中对陆地棉FPS基因序列比对表明,GhFPS1和来自亚洲薯、黄芪、乌拉尔甘草的FPS氨基酸序列具有81%-89%的相似度。GhFPS2的氨基酸序列和来自向日葵、人参、雷公藤的FPS氨基酸序列具有83%-88%的相似性。聚类分析表明,陆地棉、亚洲棉和土沉香的法尼基焦磷酸合酶氨基酸序列属于同一分枝,表明这些植物在FPS进化方面具有较近关系。  2.陆地棉FPS的表达特性研究:运用RT-PCR方法对陆地棉中FPS表达特性分析表明,在未处理的陆地棉植株中,GhFPS1和GhFPS2在叶子中表达量明显高于根、茎、叶柄等其它组织的表达量。当陆地棉被茉莉酸甲酯处理16h后,被处理植株的4处组织中GhFPS1和GhFPS2的表达量都高于未处理植株,并且在叶和茎中GhFPS1的表达量明显高于GhFPS2,根和叶柄中GhFPS2的表达量明显高于GhFPS1。当陆地棉植株被水杨酸甲酯处理16 h后,被处理植株的根、茎、叶中GhFPS1的表达量明显高于GhFPS2,然而在叶柄中GhFPS2的表达量明显高于GhFPS1。  3.陆地棉FPS基因的酶活性分析:在大肠杆菌中表达GhFPS1和GhFPS2基因,与前体化合物IPP和GPP一起进行体外催化反应来检测陆地棉GhFPS1和GhFPS2的酶活性,产物通过GC-MS检测。通过质谱检测和与标准物质比对,表明陆地棉法尼基焦磷酸合酶基因GhFPS1和GhFPS2都可以将底物IPP和GPP转化为一种主要产物法尼醇。  4.烟蚜茧蜂对法尼醇和(E)-β-法尼烯的电生理反应及趋向行为研究。选取两天左右大的烟蚜茧蜂(Aphidius gifuensis)触角来记录其对法尼醇和EβF的电生理反应,法尼醇和(E)-β-法尼烯浓度分别为0.01、0.1、1、10、100μg/μl。结果表明,在0.01、0.1μg/μl时,雌雄烟蚜茧蜂对(E)-β-法尼烯均无反应,在1、10、100μ.g/μl时,雌茧蜂的电生理反应值明显高于雄茧蜂;对于法尼醇,在0.01、0.1μg/μl时,雌雄烟蚜茧蜂对法尼醇均无反应,在10μg/μl和100μgμl浓度下,雌茧蜂的电生理反应值明显高于雄茧蜂,但是在1μg/μl时,雄茧蜂的电生理反应值稍高于雌茧蜂。在Y-形管行为实验中,法尼醇和(E)-β-法尼烯亦对雌性烟蚜茧蜂表现出了较强的吸引作用。
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